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 (ウェスタンブロット)
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Simple Western 受託解析サービス(全く新しいウェスタンブロット)
-ProteinSimple社製 Wesを用いた全自動キャピラリー電気泳動イムノアッセイサービス-
ProteinSimple社の全自動キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステム「Wes system」を使用した受託解析サービスをご提供しています。解析作業は、弊社(名古屋本社)受託解析センター内にて行っています。
ProteinSimple社製 Wesでは、タンパク質分離を分子量のみで行うSimple Western
(TM)サイズベースアッセイを用いて、サンプルのロード、サイズベースのタンパク質分離、免疫反応、洗浄、検出、データ解析の全ての工程が自動化されています。
Simple Western
(TM)サイズベースアッセイは、広く使われている分離技術であるキャピラリー電気泳動と、イムノアッセイを組み合わせたもので、ばらつきが小さく、高い再現性が実現されています。


 特徴


ウェスタンブロットのプロトコールで使用していたのと同じ抗体をSimple Western(TM)に利用できます。  
Wes 
専用設計されたキャピラリーカートリッジを用いて、最大24サンプルを同時測定することができます。(ラダー使用分を除く)
12-230kDa、または、66-440kDaの大きさのタンパク質を分離し、解析することができます。
専用のCompassソフトウェアで自動的に再現性高く解析されます。
従来のウェスタンブロットよりもばらつきが小さく、再現性が高い。
(測定内CV<15%, Hela細胞ライセートを用いたERK1検出時)


 ゲル画像例

抗体を用いた免疫検出(右)


 Simple Western(TM) サイズベースアッセイの原理


Simple Western(TM)受託解析サービスで使用するProteinSimple社製Wesは、ゲルの準備(カートリッジ)・サンプルのロード・分離モニター・ブロッティング・ブロッキング・インキュベーション・洗浄・シグナル検出・データ解析をすべて自動的に行います。
タンパク質がキャピラリー内で分離された後に、光化学反応によりキャピラリー内壁にタンパク質がトラップ(固相化)されます。
ゲルマトリックスを洗い流した後、一次抗体および二次抗体の免疫反応を行い、化学発光反応でタンパク質が特異的に検出されます。この化学発光シグナルを画像として検出し、解析します。


 解析の流れ


1. 解析サンプル・一次抗体・二次抗体の送付


































































































弊社宛に、解析サンプル・一次抗体・二次抗体とQCシートを併せてご送付ください。
送付された内容物とQCシートの内容が一致するかを弊社で受け入れ確認します。

(送付先)
フィルジェン株式会社 バイオサイエンス部 受託グループ
〒459-8011 愛知県名古屋市緑区定納山一丁目1409番地
Tel 052-624-4388 Fax 052-624-4389

■解析サンプルについて

ご送付サンプル サンプル使用量 ご送付液量 ご送付サンプル濃度 ご送付方法 備考
ライセートタンパク質 1ug/well 程度 10uL以上 0.5~2mg/mL(*1) -20℃以下 Bufferについては、以下の「使用Buffer例」をご参照ください。
使用Buffer例(*2)
Composition of all buffers tested:
HEPES pH8.0(50mM, 25mM, 10mM)/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
TrisCl pH7.5(50mM, 25mM, 10mM)/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Phosphate NaH2PO4/Na2HPO4(20mM, 10mM)/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
NaCl(700mM, 300mM, 100mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
NH4Cl(300mM, 150mM, 75mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
NH4Cl(100mM, 50mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
MgCl2(10mM, 3mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Bromophenol Blue(0.01%, 0.005%, 0.001%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Phenol Red(0.01%, 0.005%, 0.001%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/2% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/2%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/TritonX(2%, 1%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/TritonX(1%, 0.5%, 0.25%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/NP40(2%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/NP40(1%, 0.5%, 0.25%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/lgepal Ca960(1%, 0.5%, 0.25%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/C7BzO(1%, 0.5%, 0.1%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/Sodium deoxycholate(1.2%, 0.6%, 0.3%)/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/LDS(2%, 1%, 0.5%)/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/80mM DTT
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/BME(400mM, 40mM)
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/TCEP(10mM, 1mM)
20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/TCEP(1mM, 0.5mM)
Imidazol(100mM, 50mM, 20mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/EDTA(20mM, 10mM, 5mM)/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
20mM Bicine pH7.6/EDTA(40mM, 20mM)/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Glycerol(20%, 10%, 5%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Sucrose(300mM, 150mM, 75mM)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Formaldehyde(2%, 1%, 0.5%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Formaldehyde(0.1%, 0.05%, 0.01%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Urea(8M, 4M, 2M, 1M)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Urea(8M, 2.7M, 0.9M)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
Urea/Thiourea(5M/1M, 2M/0.4M, 1M/0.2M)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
PEG MW 20000(5%, 2%, 1%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
PEG MW 20000(1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT
PEG MW 4400-4800(10%, 5%, 2.5%)/20mM Bicine pH7.6/0.6% CHAPS/1%SDS/40mM DTT

(解析サンプルに関する注意点
*1 ライセートタンパク質は、上記濃度範囲内で、予め濃度が統一された状態でご送付ください。
ライセートタンパク質の濃度が上記濃度範囲よりも高濃度の場合や、サンプル間で統一されていない場合、サンプル調整費用が別途必要になります。
ライセートタンパク質の濃度が上記濃度範囲よりも著しく低い場合、測定可能なタンパク質量に満たない可能性が高くなります。濃縮は致しかねますので、ご了承ください。
*2 「使用Buffer例」に含まれるBuffer成分は、あくまでも参考例です。その他の成分などが、測定結果に影響を及ぼすことがあります。
上記「使用Buffer例」にないBufferや、市販のBufferをご使用の場合、事前にご連絡をください。
いかなるBufferをご使用の場合も、ご使用のBufferの詳細(含有成分の種類および濃度)を、QCシートに必ず明記してください。
* ライセートタンパク質の濃度(定量方法も明記してください)、液量、ご使用のBufferなどの必要事項を、必ずQCシートにご記入ください。QCシートに未記入の項目がある場合、確認作業により、標準納期よりお時間を頂戴する場合がありますので、ご注意ください。
* ウェスタンブロットでの解析経験がある場合、解析に用いたサンプル濃度及び使用量、抗体希釈倍率及び使用量をQCシートにご記入ください。作業の参考にいたします。
* ライセートタンパク質中の標的分子の含有量によっては、測定希釈倍率(サンプルに依存する適切な測定濃度)が大きく変わります。主成分となるタンパク質が含まれている場合などは、ご注意ください。
* ご指定のサンプル測定濃度がある場合、事前に担当までお問い合わせください。
* 上記のサンプル使用量または使用Buffer例は、あくまでも実験~解析できるものとして想定されるものです。本サービスにおいて、標的分子が検出されることを保証したものではありませんので、予めご了承ください。

(その他の注意点)
サンプルの発送は、必ず、「サンプル送付方法およびご注意点(PDF)」をご参照の上、その内容に従って行ってください。
サンプル名は、半角英数10文字以内で表記してください。記号は、ハイフン(-)、アンダーバー(_)のみご使用頂けます。また、サンプル名は、個人情報等が特定されない様に、匿名化してください。サービス着手前に、サンプル名にて個人情報等が特定されると推測できる場合は、サンプル名の変更をお願いすることがありますので、予めご了承ください。
サンプルの入ったチューブに油性マジックでサンプル名を明記し、砕いたドライアイスとともに梱包してクール便でお送りください。その際、サンプルが凍結しないことを確認してください。
受託サービスQCシートは、必要事項をご記入の上、pdfファイルにて、弊社アドレス(biosupport@filgen.jp)まで送信してください。また、サンプル送付の際には、受託解析サービスQCシート及びサンプルリストの印刷物を同封してお送りください。同シートがご送付されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスの着手が遅れる場合がありますが、予めご了承ください。
ご発送時は、冷凍宅配便をご指定ください。輸送時のトラブルに関しては、弊社ではその責任を負いかねます。
お預かりできるサンプルは、文部科学省が「遺伝子組み換え生物等の使用等の規制による生物多様性の確保に関する法律」にて定めるP1レベルに限らせて頂きます。
ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。
ご提供頂くサンプル及び本作業から生じる知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題については、弊社では一切の責を負いかねます。
お送り頂いたサンプルは、返却いたしかねます。実験後のサンプルにつきましては、基本的には弊社側にて破棄させて頂きますので、ご了承ください。
弊社営業日・営業時間は、土日祝祭日や年末年始などを除く、平日9時から17時までとなっております。サンプルの弊社到着日にご注意ください。また、休日をはさまない様に発送してください。
本確認事項を満たさない事項で、別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。

■一次抗体および二次抗体について
抗体
使用液量
ご送付液量 ご送付方法 備考
一次抗体 10uL/well ご購入時の状態(原液)でお送りください。
*分注する場合:15uL以上
4℃または-20℃以下
*データシート記載の保存方法を参照してください。
「Simple Western Antibody Database(*1)」より、一次抗体を検索・選択の上、ご準備ください。
*希釈倍率は、「Simple Western Antibody Database
(*1)」に準じます。
二次抗体 10uL/well 【一次抗体のホストがMouseまたはRabbitの場合】
キット添付の二次抗体を使用します。
*事前に抗マウス二次抗体または、抗ウサギ二次抗体をご選択ください。

【一次抗体のホストがその他の生物種の場合】
「Simple Western Antibody Database
(*1)」より、二次抗体を検索・選択の上、ご準備ください。
*希釈倍率は、「Simple Western Antibody Database
(*1)」に準じます。

(抗体に関する注意点)
*1 「Simple Western Antibody Database」のURLは、「http://www.proteinsimple.jp/antibody/antibodies.html」です。随時、情報が更新されているため、最新の情報にご注意ください。
「Simple Western Antibody Database」に記載された希釈倍率または濃度は、あくまでも参考例です。本サービスにおいて、標的分子が検出されることを保証したものではありませんので、予めご了承ください。
*2 抗体の希釈倍率は、「Simple Western Antibody Database」に準じます。希釈倍率に範囲がある場合、高濃度を採用いたします。抗体を分注して送付する場合は、ご注意ください。
基本的には、ご購入時のままの状態(原液)でお送りください。抗体を分注して送付する場合は、「Simple Western Antibody Database」の希釈倍率をご参照の上、測定well数にあわせて必要量をご送付ください。
*3 内在性コントロールの同時解析をご希望の場合は、一次抗体と同一生物種の該当する抗体をお送りください。追加料金はかかりません。標的分子のサイズと被らないこと、また、同一検出範囲内に収まることが条件となります。
* 抗体の種類、濃度、液量などの必要事項を、必ずQCシートにご記入ください。QCシートに未記入の項目がある場合、確認作業により、標準納期よりも長くお時間を頂戴する場合がありますので、ご注意ください。
* ウェスタンブロットでの測定経験があるサンプル及び抗体の場合、測定に用いたサンプル濃度および使用量、抗体希釈倍率および使用量をQCシートにご記入ください。作業の参考にさせて頂きます。
* 抗体ご購入時のデータシートまたはコピーを、サンプルおよび抗体ご送付時に添付してください。
 
2. 測定サンプルの調整
キット添付のSample buffer(SDS, DTT含有)を用いて、0.2mg/mL程度に調整を行います。
3. 一次抗体及び二次抗体の調整
キット添付のAntibody Diluent Ⅱを用いて抗体の調整を行います。
二次抗体は、キット添付の二次抗体をProtocolに準じて使用します。
Simple Western Antibody Databaseよりご選択頂いた一次抗体または二次抗体は、Database記載の希釈倍率に準じます。
4. 測定及び解析
ProteinSimple社製Wes及び、Master Kitを用いて測定を行います。専用のCompassソフトウェアで自動的に解析を行います。免疫検出されたそれぞれのタンパク質について、擬似的なゲル画像、分子量、シグナル強度(面積)、S/N比など多くの情報が得られます。
5. 解析データのご報告  【解析データ例

データ解析結果をCD-ROMに収録し、ご報告いたします。納期は、使用キット入荷及びサンプル・抗体到着後、20~25営業日程度です。

*使用キット納期(通常3~4週間程度)・解析サンプル総数などにより、標準納期に加え、お時間を頂戴する場合があります。詳しくは、担当までお問い合わせください。





 価格


サービス名 検出範囲
(*2)
一次抗体
(*3)
 
二次抗体 税別価格 Cat.#
Simple Western(TM)受託解析サービス
13キャピラリー用基本料金(*6, *7)
*最大8カートリッジ
2~40kDa 「Simple Western Antibody
Database(*4)」より、
一次抗体を検索・選択の上、
ご準備ください。
ラビット ¥117,800 F-SWES-SM-
W010A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W010A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W010A-DM003A
12~230kDa ラビット F-SWES-SM-
W002A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W002A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W002A-DM003A
66~440kDa ラビット F-SWES-SM-
W006A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W006A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W006A-DM003A
Simple Western(TM)受託解析サービス
25キャピラリー用基本料金(*6, *7)
*最大8カートリッジ
2~40kDa 「Simple Western Antibody
Database(*4)」より、
一次抗体を検索・選択の上、
ご準備ください。
ラビット ¥163,900 F-SWES-SM-
W012A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W012A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W012A-DM003A
12~230kDa ラビット F-SWES-SM-
W004A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W004A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W004A-DM003A
66~440kDa ラビット F-SWES-SM-
W008A-DM001A
マウス F-SWES-SM-
W008A-DM002A
その他 F-SWES-SM-
W008A-DM003A
反応料金
1カートリッジ(13キャピラリー)反応料金 *最大12反応(*1) ¥100,000 F-SWES-13C
-(カートリッジ数)
1カートリッジ(25キャピラリー)反応料金 *最大24反応(*1) ¥130,000 F-SWES-25C
-(カートリッジ数)
*1 ラダー(タンパク質分子量マーカー)の測定も行います。
*2 検出範囲は、測定タンパク質の分子量を目安にした、おおよその検出可能範囲の目安です。測定タンパク質に応じた範囲をご選択ください。
*3 測定1回にて、画像結果が1ファイルになります。複数種類の組み合わせにより、キャピラリー間でのバックグラウンドや検出感度の差などにより、画像解析が困難になる場合があります。複数種類の組み合わせにて測定をご希望の場合、一次抗体および二次抗体の組み合わせ数に応じてご発注ください。
*4 「Simple Western Antibody Database」のURLは、「http://www.proteinsimple.jp/antibody/antibodies.html」です。
*5 試薬キット添付の二次抗体を用います。二次抗体の生物種により使用キットが異なりますので、ご準備頂いた一次抗体に応じた二次抗体の生物種をご選択ください。
*6 3ヶ月以内の追加解析の場合、基本料金なしで追加解析可能です(最大8カートリッジまで)。
*7 カートリッジ間のデータを比較する場合は、別途System Control料金(¥13,100(税別))が必要となります。
*8 二次抗体のホストがその他の場合、「Simple Western Antibody Database(*4)」より、二次抗体を検索・選択の上、ご準備ください。
* QCシートは、弊社Webサイト「ダウンロード/受託解析のQCシート(http://www.filgen.jp/catarogue/index-qc.html)」からダウンロードし、必要事項をご記入の上、サンプルと同送してください。
* 本サービスは、研究目的での解析に限ります。ヒトへの感染性が疑われる試料の場合、受け入れをお断りいたしますので、予めご了承ください。
* タンパク質試料溶液含有物や抗体とのマッチングなどの要因により、すべての実験系において、目的分子が検出可能とは限らないことを予めご了承ください。
* 結果の如何に関わらず、作業料金をご請求させて頂きます。


 Selected References


1. Automated capillary Western dot blot method for the identity of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine
Melissa Hamm, Sha Ha, Richard R. Rustandi, Analytical Biochemistry, Jun 2015; Vol 478 (2015) doi:10.1016/j.ab.2015.03.021
2. Protein Detection by Simple Western™ Analysis
Valerie Harris, Western Blotting: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 1312, Jun 2015; DOI 10.1007/978-1-4939-2694-7_47
3. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system
Jin-Qiu Chen, Madeleine R. Heldman, Michelle A. Herrmann, Noemi Kedei, Wonhee Woo, Peter M. Blumberg, and Paul K. Goldsmith, Anal Biochem, Nov 2013; 442(1):97-103
4. Not Your PI's Western Blot
Anne Harding, Science, Mar 2013; 339: 1100-1103
5. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis-Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research
S-B Liu, S. Sardi, B. Sonom, D. Zocco, R. McSweeney, A.D. Fraser, A.E. Halleck, H. Li, G.B. Smejkal, S. Munevar, J.G. Jin, T. Kawai, I. Ghiran, J.P. McGrath, M. Whitman, S-W Ng, and W.P. Kuo, Bioanal Biomed, Mar 2013; S3:1-10
6. The Simple Western: A gel-free, blot-free, hands-free Western blotting reinvention
Uyen Nguyen, Nick Squaglia, Annegret Boge and Peter A. Fung, Nat Meth, Nov 2011; 8(11)


*本サイトの情報は、ProteinSimple社のHomepageの情報を一部引用しております。

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