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ClearLight Biotechnologies社製品
組織透明化試薬
CLARITYの概要 / CLARITY組織処理ワークフロー / 組織透明化試薬の比較 / 製品紹介 / 参考文献

ClearLight Biotechnologies社は、CLARITY組織透明化試薬、およびCLARITY組織透明化、3D免疫染色、およびTru3D画像分析サービスを提供しています。


CLARITYの概要


CLARITY(
Clear Lipid exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel)は、ハイドロゲルマトリックスに組織を埋め込みます。このハイドロゲルが組織サンプルを支持し、重要な組織内容物の構造的完全性と空間的配向を保持する3次元マトリックスを提供します。脂質などの重要ではない要素は界面活性剤を用いて除去され、光を透過し、分子の浸透性を有する光学的な透明なハイブリッドが作成されます。その後分子マーカーを追加し、特定の機能を強調させ、さらに画像化および分析することが可能です。
組織処理のワークフローには、染色の洗浄を含めることができ、分子ラベリングとイメージングを複数回行うことが可能です。


◆組織処理でCLARITYを使用するメリット
凍結済み、新鮮、ホルマリン固定済み、FFPE包埋組織など、従来の病理ワークフロー手法と互換性あり
非破壊、小サンプル、空間的不均一性の再現可能
FFPEサンプルや他組織透明化技術の様に脱水や再水和のステップは必要なし
標準的な核酸および抗体調査技術と互換性あり
サンプルは将来的なバイオマーカー分析用に保存可能
共焦点、ライトシート、SPIMなどのイメージングと互換性あり


CLARITY組織処理ワークフロー

ハイドロゲルマトリックス

最初のステップで固定されたマウス、ラットまたはヒト組織サンプルをハイドロゲルモノマーとクロスリンカー溶液に入れます。
詳細な説明に関しては、こちらをご確認ください。
生体分子の機能化

モノマーとクロスリンカーは組織の細胞内に拡散し、タンパク質や核酸などの生体分子に結合し、光散乱脂質には結合しません。
重合

ハイドロゲルは熱処理され、モノマーは安定した網目構造となり、タンパク質や生体分子を所定の位置に固定します。
脂質の除去

界面活性剤は、脂質やその他結合していない分子を、組織から除去するために使用されます。タンパク質、核酸、その他結合生体分子は、ハイドロゲルメッシュ内に残ります。
免疫染色

組織内の特定の構造を強調するために、抗体ベース免疫染色または、マルチプレックスによる核酸(RNA/DNA)標識の使用が可能です。
詳細は、こちらをご確認ください。
画像分析

染色した組織は、共焦点顕微鏡またはライトシート顕微鏡または別の3Dイメージングプラットフォームでイメージングを行うために、屈折率を一致させるマウンティングソリューション内に置きます。


組織透明化試薬の比較


CLARITY、CUBIC、iDISCO、V社製品の中で、後者の3つは、先に免疫染色を行い、有機溶媒を使用して組織の透明化および屈折率(RI)マッチングを行います。これにより組織が「透明」になる可能性があります。実際の組織内の特定のターゲットの抗原や受容体が保持されているかを検証するために、4つの方法で比較を行いました。

◆ワークフローの比較
ワークフロー
CLARITY 組織透明化 免疫染色 RIマッチ
CUBIC 免疫染色 組織透明化/RIマッチ
iDISCO 免疫染色 組織透明化/RIマッチ
V社製品 免疫染色 組織透明化/RIマッチ

◆組織透明化比較
組織透明化比較1:

マウス腎臓を透明化し、RIマッチしたサンプル比較。
これは各組織透明化プロトコルを使用した透明化されたマウスの腎臓です。すべてのサンプルはRIマッチされています。

4つの組織は全て光学的に透明に見えますが、よく調べてみると、CLARITYで処理されたサンプルのみが元の厚さを維持しています。CUBICサンプルはわずかにかすんで見え、iDISCOサンプルやV社製品サンプルは肉眼では非常に鮮明に見えますが、わずかに劣化している様に見えます。


組織透明化比較2:

MCF7異種移植片を透明化し、RIマッチしたサンプル比較。
これは各組織透明化プロトコルを使用して透明化されたMCF7異種移植片です。全てのサンプルはRIマッチされています。

CUBICで処理されたサンプルはわずかにかすんで見えます。
CLARITYサンプルは堅牢で、上記比較1の腎臓サンプルの結果よりも透明に見えます。これは血管新生と構造の欠如が原因である可能性があり、腎臓で強調されるため、結果は一貫しています。
iDISCOおよびV社製品で処理されたサンプルは非常に鮮明に見えますが、エッジの周りが薄くなっています。サンプルは、CLARITYで処理されたサンプルと比較して堅牢に見えません。

◆免疫染色比較

CLARITY処理されたマウス腎臓
マウスの腎臓をアルファ平滑筋アクチン(α-SMA)で免疫染色しました。CLARITY技術を使用して腎臓サンプル全体に存在する血管系の分岐をはっきりと確認することが可能です。シグナルも強く、視点を標準のXYビューからXZビューに回転させても、小分枝と主要分枝を維持可能です。これは二次元で観察する場合、はっきりと確認できません。


CUBIC処理されたマウス腎臓
CUBICの場合、浸透が不足しているため、zスタックの深さが減少し、分枝が見られますがそれほど明確ではありません。
CUBICサンプルでは、深く観察することができず、シグナルは不均一で弱いです。


iDISCOおよびV社製品で処理されたマウス腎臓
これらの二つのサンプルでは、視認可能な分枝が存在しますが、zスタックの深さはCLARITYと比較して減少しています。


【マウス腎臓をPAX8で免疫染色した際の比較】



マウス腎臓を別のマーカーであるPAX8で免疫染色することで、違いが明らかになります。
CUBICではPAX8シグナルは見られます。しかし、DAPIシグナルは減少しています。
iDISCOおよびV社製品サンプルでは、DAPIのシグナルは強いですが、 PAX8シグナルが全体的に減少している様に見えます。
これらは、バイオマーカーの発現にトレードオフの起きている可能性を示しています。
どちらのバイオマーカーでも明確で均一なシグナルがあったCLARITY処理サンプルとは対照的です。
CLARITYを使用すると2Dスライスビューでも堅牢なPAX8およびDAPIシグナルが得られます。


【MCF-7マウス異種移植片をPan-Cytokeratin(Pan-CK)で免疫染色した際の比較】



マウス異種移植片をPan-CKを使用した免疫染色
CLARITYでは強いpan-CKシグナルとDAPIシグナルが維持されます。これは2Dスライスビューで非常に明白なことがわかります。CUBICを使用すると、pan-CKシグナルがありますが、明瞭で明るくは見えません。また、DAPIシグナルの減少が観察されています。
iDISCOおよびV社製品では、表面染色が観察されました。Pan-CKは完全には組織を貫通していません。DAPIシグナルは維持している様に見えますが、2Dスライスでは明確な核を見ることはできません。これはみたいものとの間のトレードオフを表しています。核の対比染色と関心のあるターゲットを一緒に見ることが必要な場合、コントラストが真のシグナルを確認するのに役立ちます。
ClearLight社は、厚組織への抗体浸透の専門家です。厚い組織への抗体浸透率を改善すると、細胞および細胞内構造を視覚化する能力が向上します。このMCF-7マウス異種移植片の結果により、Clearlightは高いS/N比を達成できることが明らかになりました。


【MCF-7マウス異種移植片を免疫染色した際の比較】



このMCF-7マウス異種移植片は、Ki67を使用して免疫染色されました。CLARITYを使用すると、全体的に均一な浸透とKi67による染色が見られます。2Dスライスビューでは、Ki67と一致する明確で識別可能なDAPI染色も観察可能です。
CUBICでは、バックグラウンド染色とのオフターゲットが少し観察される不均一で一貫性のない染色が得られます。同じことがiDISCOとV社製品でも見られます。加えてiDISCOおよびV社製品はエピトープ損傷が発生している様に見えるため、DAPIまたはKi67の均一な染色が得られません。


製品紹介


◆透明化試薬
軟組織の脂質透明化を行いたい研究者のための組織透明化試薬です。
対象組織により高脂質バージョンと低脂質バージョンを選択してください。

品番 TCK-HL TCK-LL
品名 CLARITY Tissue Cleaning Kit - High Lipid CLARITY Tissue Cleaning Kit - Low Lipid
-
対象サンプル 脳組織、目、リンパ節 腎臓、ほとんどのがん組織、肝臓、扁桃腺など
キット内容物
CLARITY Lipid Embedding Solution-High Lipid(90ml)
Thermal Initlator(1g)
Wash Buffer 1(101ml)
CLARITY Lipid Clearing Solution(1000ml)
Wash Buffer 2(101ml)
取り扱い説明書
CLARITY Lipid Embedding Solution-Low Lipid(62.5ml)
Thermal Initlator(1g)
Wash Buffer 1(101ml)
CLARITY Lipid Clearing Solution(1000ml)
Wash Buffer 2(101ml)
取り扱い説明書
税別価格 ¥107,000 ¥107,000

◆免疫染色バッファー
透明化試薬を使用して透明化された組織の免疫染色用に最適化されたバッファーです。
品番 TCR-IB
品名 Immunostaining Buffer
-
キット内容物
Immunostaining Buffer(105ml)
税別価格 ¥41,000

◆セット価格
上記透明化試薬と免疫染色バッファーのセット価格です。
品番 TCK-HL-Combo TCK-LL-Combo
品名 High Lipid Kit + Immunostaining Buffer Low Lipid Kit + Immunostaining Buffer
税別価格 ¥122,000 ¥122,000

◆キット以外に必要なもの
ddH2O
攪拌棒
乾燥チャンバー
真空ポンプ
窒素ガス
ウォーターバス
インキュベーター/シェーカー
スパチュラ
キムワイプ
1xPBS
1xPBS+NaN3(0.01%, w/v)
ピペットおよびピペットチップ
マルチウェルプレート
コニカルチューブ
プレートシーリングテープ
屈折率マッチングソリューション
イメージングプラットフォーム

【関連ページ】
 ⇒ClearLight社の透明化試薬を使用した受託サービスもご提供しております。(リンク先工事中)


参考文献


注意事項

本キットは、研究用として販売しております。ヒト、動物への医療・臨床診断用には使用しない様にご注意ください。また、食品・化粧品・家庭用品などとして使用しないでください。
無断で承認を得ず、製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されております。

お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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