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Home製品・サービス情報試薬・材料・消耗品>PixelBiotech社製 multiplex single molecule FISH probe カスタム作成

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PixelBiotech社製
Multiplex single mulecule FISH(smFISH) probe カスタム作成

PixelBiotech社(ドイツ)は、独自の技術を採用したマルチプレックスsmFISH(single molecule Fluorescence In Situ-Hybridization)プローブのカスタム作成を行っています。また、AIを利用した画像解析プラットフォームを開発したことにより、正確かつ手頃な価格で、簡単に解析が可能です。



 smFISH


smFISHは、Single molecule Fluorescence In Situ Hybridization の略称であり、サンプル内の標的RNA配列がサンプル内のどこに存在しているかを明らかにするための手法です。標的RNAの配列に対して相補的な配列を持つオリゴを蛍光標識し、RNAとオリゴの結合によってRNAを可視化します。smFISHでは標的RNAに対して、配列の異なる数十種類のオリゴを結合させることにより、標的RNAを明瞭にイメージングすることが可能です。
 
チラシダウンロード(PDF)


 独自の技術を採用したHuluFISHテクノロジー


HuluFISHは、単一のハイブリダイゼーション反応で複数の蛍光標識の適用を実現するための、smFISH用のマルチ蛍光標識法です。HuluFISHのマルチプレックス数は、蛍光タイプの数の増加に伴って指数関数的に増加します。この方法を使用することで、単一細胞レベルでsmFISH解析をすることが可能です。

GAPDH 6μm Mouse Brain Platynereis TLX

◆HuluFISHプローブの仕組み

様々な蛍光標識を選択してDNA分子を結合した後、T4 DNAリガーゼを使用して、複数の蛍光標識された蛍光オリゴ(Hulu)を標的遺伝子特異的オリゴ(GSO)に結合させます。複数の蛍光標識されたHuluFISHプローブを用意することで、1回のハイブリダイゼーション反応で多数の遺伝子発現を視覚的に区別して検出することが可能です。


3つの蛍光を区別することができるレーザーを搭載した共焦点顕微鏡を使用することで下記の図の様に、7つの遺伝子を同時に検出することが可能です。3つの基本色の組み合わせにより、1回のハイブリダイゼーション反応で7つの遺伝子を検出することができ、結果として得られるマルチチャネルイメージングデータは、AIを利用した定量ソフトウェアHuluREADを利用することで簡単に解析することができます。


◆HuluFISHの主なアプリケーション

HuluFISHは、対象を絞った遺伝子検査を必要とするあらゆる学術研究または臨床研究に適用できます。例えば、HuluFISHはNGSによる解析結果を補完する優れたテクノロジーであり、正確なイメージングベースの遺伝子発現検証が可能です。HuluFISHは、単一のハイブリダイゼーション反応で複数の蛍光標識を用いることができるため、創薬、シングルセルRNAシークエンスの検証などの多くの複雑な研究に活用することができます。

Single Cell Single Molecule Research
実験用に選択および最適化された、高度にカスタマイズ可能なsmFISHプローブを提供します。
さらに、AIを利用した画像分析およびデータ定量化ソフトウェアを無料でご利用頂けます。
CAR T-Cell Therapy Quality Control
ヒトT細胞におけるCAR遺伝子発現の単一分子精度での業界初の検出に成功し、再現性の高い結果をもたらします。
African Swine Fever Screening
アフリカ豚コレラ(ASF)の発生は、2018年だけでも中国の養豚業者に数億ドルの損失をもたらしました。
PixelBiotech社は、この問題を解決するためのHuluFISHに基づくユニバーサル病原体検出用プローブを開発しました。

◆HuluFISHキット

HuluFISHキットには、カスタム作成されたHuluFISHプローブと、その他の消耗品が含まれています。PixelBiotech社のHuluFISHプローブは、選択した遺伝子配列によりカスタム作成をします。プローブ設計は、結合品質の高い最適なHuluFISHプローブを自動的に作成します。
通常の HuluFISH Kit とFFPEサンプル用の HuluFISH plus kit の2つからお選びいただけます。HuluFISH plus kit は、通常のサンプルよりバックグラウンドが高く、低いクオリティーRNAを含むFFPEサンプルでも機能する様に蛍光シグナルがおよそ9倍に増強されています。

<キット内容>
・カスタム作成されたHuluFISHプローブ(プローブ長:17-21bp)
・HuluHyb solution(2xSSC, 2M Urea, 10% dextran sulfate, 5x Denhardt's solution)
・HuluWash solution(2xSSC, 2M Urea)

ステップ1-HuluFISHキットを注文する
キットの種類とサイズを選択した後、ターゲット遺伝子を選択し、遺伝子名、転写物ID、またはFASTA配列によるターゲット詳細を指定します。

<キットの選択>
HuluFISH Kit or HuluFISH plus kit (FFPEサンプル用)
例1-種名と遺伝子名の名前
Human, BRCA2
例2-Ensembl gene IDやtranscript ID
ENSG00000171867
ステップ2-HuluFISHキットを受け取る
カスタム作成されたHuluFISHプローブと必要な試薬が含まれたHuluFISHキットを受け取ります。
・HuluFISHプローブ
・試薬
・ユーザーガイド
ステップ3-HuluFISHによるイメージング
1.サンプル準備
2.サンプル別の推奨プロトコルを参考に実験
3.イメージングデータを収集して保存
サンプル別の推奨プロトコル
Tissue Tissue
HuluFISH
Plus
Cell On Chip Whole
Mount
ステップ4-データ定量化を行うHuluREAD
こちらのユーザーガイドをご確認ください: HuluREADユーザーガイド 

クラウドにイメージングデータをアップロードすることにより、定量レポートが自動的に送信されます。

◆HuluFISHプローブを用いたイメージングの推奨事項

HuluFISHは、主に共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングすることを推奨しています。比較的薄いサンプル(<5μm)または細胞培養サンプルを扱う場合は、落射蛍光顕微鏡を用いることが可能です。それ以外の場合は、高感度の共焦点顕微鏡またはスピニングディスク顕微鏡をお勧めします。


▲Hepa 1-6細胞における落射蛍光(左)と共焦点(右)HuluFISHイメージング

◆HuluFISH用に検証された顕微鏡

下記にリストされている様々な顕微鏡で、HuluFISHイメージングの検証を行いました。
顕微鏡タイプ メーカー モデル 使用例
落射蛍光 Zeiss Cell Observer 細胞培養サンプルのイメージング
広い範囲
落射蛍光 Metasystems Metafer 自動化された広い範囲のイメージング
共焦点 Zeiss LSM 710 組織または細胞サンプルのイメージング
共焦点 Zeiss LSM 800 組織または細胞サンプルのイメージング
共焦点 Zeiss LSM 880 組織または細胞サンプルのイメージング
High multiplexing
共焦点 Leica TCS SP8 組織または細胞サンプルのイメージング
スピニングディスク Leica DMi8 Spining Disk 組織または細胞サンプルのイメージング
広い範囲
スピニングディスク Andor Instrument Dragonfly 組織または細胞サンプルのイメージング
広い範囲、High multiplexing
超解像 Zeiss LSM800/880 with Airyscan 組織または細胞サンプルのイメージング
超解像 Nikon NSIM 組織または細胞サンプルのイメージング
優れたS/N比
超解像 Leica STED 3D 組織または細胞サンプルのイメージング
超解像

smFISH RNA 蛍光ドットは非常に小さく、生体サンプルに密集している可能性があります。各HuluFISH蛍光ドットは65nm以下の直径のドットとして表示されます。従来の顕微鏡(落射蛍光および共焦点)では、良好な解像度を得るために、NA>1.3の60倍以上の倍率のオイル対物レンズの使用が推奨されます。下記の表はテスト結果の要約を示しています。
対物レンズ倍率 開口数(NA) 対物レンズタイプ -
<25x 0.5-0.8 空気/水浸 それぞれのRNA蛍光ドットを分離するには、空間分解能が不十分であり、解像度が低い。
40x 1.2 水浸 Zeiss LS880 with Airyscan および Metasytems Metafer でうまく機能しますが、高密度のRNAドットの解像度は低下。
63x 1.4 油浸 Zeiss LSM710/800/880、Leica SP8、Zeiss Cell Obserever、Metasystems Metafer、Leica STED 3D、Dragonfly Andor、Leica DMi8 Spining Disk で非常に優れた解像度。
100x 1.4 油浸 Zeiss Cell Obserever、Nikon NSIM で非常に優れた解像度。

◆HuluREAD

HuluREADは、PixelBiotech社製品のユーザー向けの無料の画像データ定量化ツールです。それぞれのスポットの蛍光強度やxyz座標などの情報を出力することが可能です。HuluREADは、独自のプライベートクラウドドライブと連携しているため、データを安全に解析することが可能です。HuluREADをご使用いただくには、次のクラウドストレージサービスプロバイダーのアカウントが必要です。

名前 プロバイダー 空き容量 LINK
Google Drive Google 15GB https://www.google.com/drive/

HuluREADユーザーガイド 

▲形状、外観、密度が異なる細胞核のセグメンテーション(実際の顧客データ)

▲HuluFISHスポットの検出(実際の顧客データ)


 価格

製品名 容量 税別価格
HuluFISH Kit - Nano 20反応 ¥102,000
HuluFISH Kit - Mini 80反応 ¥148,000
HuluFISH Kit - Midi 400反応 ¥203,000
HuluFISH Kit - Maxi 1000反応 ¥313,000
HuluFISH plus probe mini Kit ※ 80反応 ¥313,000


 参考文献

1. Bury, L. et al. Alpha-satellite RNA transcripts are repressed by centromere-nucleolus associations. eLife 2020;9:e59770
2. Marchiò, C. et al. Evolving concepts in HER2 evaluation in breast cancer: Heterogeneity, HER2-low carcinomas and beyond. Seminars in Cancer Biology, 2020
3. Cheng, Y. et al. Autonomous combinatorial color barcoding for multiplexing single molecule RNA visualization bioRxiv 127373


お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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