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MapmyGenome India社製品
Spoligotyping kit(結核菌群の遺伝子型同定・同時検出キット)

Spoligotyping kitは、結核菌群の遺伝子型同定・同時検出において、PCRに基づいた手法を利用した有用なキットです。このキットでは、臨床サンプルにおいて、原因となるバクテリアを検出することができ、また、菌株の同定に関する疫学的な情報を得る上で非常に有効的です。
結核菌による感染において、感染の原因や動向を調べるため、早急な感染経路の解明が求められます。また、菌の種類によって臨床経過、治療法も異なるため、菌種の特定は非常に重要とされます。その様な場合に最も有効なのが遺伝学的手法によるアプローチです。結核菌の遺伝子型の分類によって、集団感染や散発的発生の相互関係を調査することができます。


特徴


S6110-RFLP分析に比べ、解析に必要なゲノムDNA量が微量です。
(1回のPCR反応に用いるゲノムDNAの必要量は、20ng程度です。)
S6110-RFLP分析と比較して、安価で、実験手法も簡便です。
1枚のメンブレンで一度に43サンプルの実験を行うことができ、PCR開始から検出までの所要時間は、最短で約6~7時間程度です。
臨床サンプルにおいて、96~98%の検出感度を有します。
IS6110-RFLP分析において、コピー数が5以下であった菌株に対する追加的検査にも用いることができます。


原理


スポリゴタイピング法は、結核菌群のゲノムDR領域に複数存在するdirect repeats(DR)配列に挟まれたスペーサー配列を可視化し、菌株間でその有無を比較することによって、結核菌の遺伝子型を解析する手法です。DR領域は、結核菌群のみに特異的に検出される繰り返しエレメントです。DR領域には、36bpからなる複数の反復配列(Directrepeat:DR)が存在し、これらのDRは、さらに37~41bpからなる、それぞれ異なった塩基配列で構成されたスペーサー配列を介して10~50コピーほど連なっています(図1)。DR領域に含まれるDRの数は菌株間で異なり、その間にあるスペーサー配列も菌株間で異なります(図2)。スポリゴタイピング法では、このことを利用し、M.tuberculosis H37Rv と M.bovis BCG P3 の既知スペーサー配列を標準として、43個のスペーサー配列の有無を菌株間で比較することにより、菌株の遺伝子型を判別します。
図1 M.tuberculosis H37Rv と M.bovis BCG P3のゲノム中のDR領域の構造
(緑の長方形:DR配列、 黒線:スペーサー配列)
図2 異なる菌株間でのDR領域の比較
(株によってスペーサー配列やDR配列の欠損/挿入が起こる。)


実験手順概要


まず、未知の結核菌株のDR領域全体をPCRで増幅します。プライマー配列はDRに基づいており、DRに対して相補的で互いに逆方向の二つのプライマーを使用します。この様なプライマーを用いることにより、隣接するDRとの間のスペーサー、及び、より遠隔のスペーサーを増幅することができます。リバースプライマーはビオチン化されているため、合成されるすべての逆鎖はビオチンラベル化されます。この様にして、DR全体をカバーする様々な長さのビオチンラベルされたPCR産物を得ます。
メンブレンには、M.bovis BCG P3株、または、M.tuberculosis H37Rv株の既知のスペーサーに由来するスペーサーオリゴヌクレオチドが平行線状に固相化されています。ミニブロッターを用いて、オリゴヌクレオチドのラインパターンと垂直になる様に、ビオチンラベルされたPCR産物をハイブリダイズさせます。ハイブリ後、メンブレンをペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンでインキュベートし、PCR産物のビオチンと結合させます。シグナルは、ECL-detectionによる化学発光をX線フィルムへ感光させることによって検出されます。


結果例


本キットを用いた、M.tuberculosis H37Rv株、M.bovis BCG P3株、及び、異なる38株の臨床分離株のスポリゴタイピングの結果例です。各菌株間で、43個のスペーサー配列の有無を視覚化により判別できます。


スポリゴタイピング法の利点


図2で示す様に、多くの結核菌は、DR領域中にIS6110エレメントを1コピーかそれ以上を保有しています。IS6110エレメントは菌株によって、そのコピー数や位置が異なります。このことを利用し、サザンハイブリダイゼーションにより、菌株間の遺伝子型の判別を行うのが、IS6110-RFLP分析です。IS6110-RFLP分析は、結核菌ゲノムを制限酵素PvuⅡで消化したとき生成する断片を、IS6110配列をプローブとして検出し、そのバンドパターンから遺伝子型の判別をします。
しかし、IS6110-RFLP分析は、大量のゲノムDNA(約2mg)を必要とするため、菌の培養に多くの時間を要し、そのため、型別結果が得られるまでに1~1.5ヶ月ほどを要します。さらにIS6110-RFLP分析は、高度な技術が要求され、解析システムも必要とします。
それに対し、スポリゴタイピング法は、DR領域を増幅するPCRのテンプレートに用いるだけのごく微量のゲノムDNAしか必要としないため、菌を大量に培養する必要がありません。さらに、キットに含まれるメンブレンにはあらかじめ既知のスペーサーオリゴヌクレオチドが固相化されているため、PCRによってビオチン化されたPCR産物をそのままメンブレンへハイブリダイズさせることができ、操作手順も簡便です。


スポリゴタイピング法


IS6110-RFLP分析


キット内容


1. PCR反応用ポジティブコントロール 2本(12反応分)
a) positive control 1(M.tuberculosis strain H37Rv) : 25uL(10ng/uL)
b) positive control 2(M.bovis BCG P3) : 25uL(10ng/uL)
2. PCR反応用プライマー 2本(550反応分)
a) primer Dra(biotinylated)
b) primer DRb
3. spoligo-membrane 1枚
(メンブレンは、M.bovis BCG P3株、または、M.tuberculosis H37Rv株の既知のスペーサーに由来するスペーサーオリゴヌクレオチドが平行線状に固相化されています。)


その他の必要な製品


製品名 メーカー Cat.# 推奨
ハイブリダイゼーションオーブン Hybaid Maxi 14 Thermo Electron HBMSOV14220/110 -
ミニブロッター Miniblotter Ocimum Biosolutions F-OCSPK-M -
プレートクッション Foam Cushions Ocimum Biosolutions F-OCSPK-FC -
X線フィルム Hyperfilm ECL(18×24cm), 75sheets Amersham Biosciences RPN3103K
インキュベーションボックス(家庭用タッパーで可) - - -
露光カセット(24cm×30cm) Exposure cassette stainless steel with metal crossbar closure SIGMA Aldrich Z360090 -
20×SSPE UltraPure(TM) 20×SSPE Gibco BRL Life technologies inc. 15591-035 -
SDS Sodium Sulfate, Anhydrous. USP, FCC Grade(500g) BDH Laboratory Supplies 442444H
DNAポリメラーゼ Super Taq DNA polymerase(5000U) HT Biotechnology Ltd. TPO5c -
ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体 Streptavidin-POD Boehringer 1089153 -
ECL検出試薬 ECL Detection Reagents Amersham international RPN2105


価格


製品名 メーカー 税別価格 Cat.#
Spoligotyping kit Mapmygenome india ¥261,000 IM9701
Spoligotyping kit without controls and primers Mapmygenome india ¥247,000 IM9702
Foam Cushions Mapmygenome india ¥154,000 PC200
Miniblotter Mapmygenome india ¥656,000 MN45

お問い合わせ biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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