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Capital Biosciences社製品
cfDNA, Exosome 単離キット
概要 / cfDNA Isolation Kit / Exosome Isolation Kit


概要

Capital Biosciences社(アメリカ)は、循環エキソソームとリキッドバイオプシーからの cell-free DNA(cfDNA)を効率的に分離するためのキットを販売しています。SubX® cfDNA Isolation Kitは、小さなDNA断片を効率的に回収するために特別に開発されました。SubX®-Exo-DNA Kitは、プロテイナーゼKなしでリキッドバイオプシー(血漿または血清)から直接エキソソームとcfDNAを同時に単離できる様に設計されています。


cfDNA Isolation Kit(血漿, 尿, 細胞培養液)

Capital Biosciences社のDNA Isolation Kitは、カオトロピック剤を添加することなく、生体液(血清、血漿、尿、羊水、脳脊髄液)から循環DNAを捕捉する新しいDNA結合物質に基づいています。プロテイナーゼK消化は不要です。DNA単離のためのリキッドバイオプシーの標準容量は、2~5mlです。50mlまで液体を簡単にスケールアップできます。
一般的なcfDNA単離キットは、シリカ-カオトロピック塩アプローチを採用しているため、ロット間の違いなどにより、小さいDNA断片の抽出効率が低くなることがありました。
しかし、本キットは、生理学条件下で(例えば体液から直接)DNAと結合する磁気ビーズの様な dual-functional proprietary substance(SubX®)を用いて、血漿、血清、および尿サンプルから cell-free DNA(cfDNA)を分離する新しい方法を採用しているため、効率よくcfDNAを単離することができます。

【DNA単離の手順】
1. DNA結合:バイオリキッドサンプルに、SubX® と Binding Matrix を追加し、数分間遠心させます。
2. 洗浄:短時間のボルテックススピン
3. 溶出:DNAは少量(30~50μl)のバッファーで簡単に溶出されます。


図1: DNA単離ステップ
SubX® と血漿または尿を混合した後のすべての手順は、1本のチューブで行われます。各インキュベーションは時々ボルテックスしながら室温で行われます。cfDNAは65℃でビーズから溶出します。



図2:
シングルコピー遺伝子36B4についてqPCRにより推定された、正常ドナーおよびNSCL患者の血漿0.2mlからのDNA収量(A)
Qubit HS DNA Assayによって決定された1mlのプールされた血漿からのcfDNA収量(B)
プールされた血漿から単離したcfDNA中のタンパク質含量(C)
4mlの尿サンプルから単離したcfDNA。Qubit HS DNA Assayを用いてDNAを定量した。(D)



図3: B95-8細胞系培養培地からの Eppstein Barr Virus DNA 単離
細胞培養物 S1 および S2 の 3×1ml アリコートからDNAを単離した。DNA収量は、EBV特異的プライマーを用いた qPCR および Qubit HS DNA Assay により推定した。



図4:
唾液からのDNA収量は、蛍光Qubit HS DNA Assay および ヒトシングルコピー遺伝子 36B4用のプライマーを用いたリアルタイム SYBR Green qPCR により決定した(左)。
未精製の唾液と16,000×gで1分間の遠心分離後の上清からのDNA収量の比較(右)。
950mlのPBSで希釈した50mlのアリコートからDNAを単離した。ヒトシングルコピー遺伝子36B4用のプライマーを用いてリアルタイム SYBR Green qPCR によりDNAを決定した。

【価格】
製品名 容量 税別価格 Cat.#
SubX® Cell Culture Media cfDNA Isolation Kit 50 preps ¥81,000 CMDNA-0050
SubX® Urine cfDNA Isolation Kit 100 preps ¥96,000 URDNA-0100
SubX® Plasma cfDNA Isolation Kit 50 preps ¥81,000 CFDNA-0050


Exosome Isolation Kit(血漿, 尿)


SubX®-Exo-DNA キットは、プロテイナーゼKを使用せずにリキッドバイオプシー(血漿または血清)から直接エキソソームと circulating cell-free DNA(cfDNA) を同時に分離するために設計されています。bi-functional substance(SubX®)は、生理的条件下で(例えば生物学的液体中で直接)DNAを高い親和度で結合させ、続いて[DNA-SubX®]複合体を固相マトリックスに吸着させます。SubX®はリン酸基を介してDNAを捕捉し、AT/GC含有量とDNA断片長の両方に関連する偏りを排除することを可能にし、抽出効率と下流アプリケーションの精度を向上させます。この方法は、DNA捕捉のためにカオトロピック塩を必要としないため、cfDNAの希釈を抑えることができます。SubX®分子の両端にあるリン脂質結合基の特徴から、SubX®の各分子は2つのエキソソームを固定することができます(二量体化し、さらにオリゴマー化します)。SubX®は、タンパク質性の高い生体液(血清・血漿)および高塩濃度の生体液(尿・涙など)の両方でエキソソームをオリゴマー化します。液体中のSubX®分子は、10~15エキソソームまでのオリゴマー化と14K×gの短時間の遠心操作で容易に沈殿するミクロンサイズの粒子を形成します。SubX®のDNAに対する親和性(強い)とSubX®のエキソソームリン脂質複合体に対する親和性(軽度)の違いにより、総SubX®ペレットからエキソソームとcfDNAを分離することができます。強く結合した[SubX®-cfDNA-ビーズ]複合体はペレットに残り、cfDNAは溶液によってさらに分離され、エキソソームは特殊な再構成バッファーによってモノマーフォーマットで容易に回収することができます。


図1: エキソソーム単離ステップ
SubX®と血漿または尿を混合した後のすべての手順は、1本のチューブで行われます。各インキュベーションは時々ボルテックスしながら室温で行われます。エキソソームは、特別な緩衝液ERB中での再構成によってSubX®-Exosomesペレットから分離されます。



図2:
尿中の内因性エキソソームと超音波処理したスパイクDNAをSubX®で同時結合させた後、エキソソーム、続いてDNAを順次単離します。SubX®との結合前と解離後(ピンクと赤)のスパイクDNA(青)とエキソソーム(緑)のプロファイルは完全に一致しています。



図3:
AFM画像は、室温で1分間インキュベートした後に雲母に付着させたエキソソームです。
超遠心分離(A)、30%スクロース中での超遠心分離(B)、コンカナパリンAとの凝集反応(C)、HansaBioMed ImmunoBeadsによる分離(D)、SubX®による分離(E)。
スケールバーは300nmです。擬似カラー定規は、粒子の高さ(nm)を示します。SubX®で単離されたエキソソームの特徴的な粒子プロファイルは、パネル(F)に示されており、「h」はエキソソーム高さ(nm)、「I」は直径(nm)です。



図4: 電子顕微鏡像は、エキソソームの膜構造およびサイズ分布を確認しました。スケールバーは100nmです。



図5: NanoSight NS300ビデオから撮影したSubX®結合および再構成エキソソームのスナップショット画像
SubX®に結合したエキソソームは、300nm~1200nmのサイズをもつ大きな複合体を形成し、一方、特別な緩衝液ERB中で再構成した後のサイズは50~120nmの範囲内にあります。


製品名 容量 税別価格 Cat.#
SubX®-Exo Plasma Isolation Kit 100 preps  ¥96,000 EXPL-0100
SubX®-Exo Urine Isolation Kit 100 preps  ¥96,000 EXUR-0100
SubX®-Exo-DNA Isolation Kit 50 preps  ¥110,000 EXOD-0050

お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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