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RealSeq Biosciences社製品
miRNA NGS ライブラリー調製キット
RealSeq®の特長 / 細胞・組織サンプル由来のmiRNAライブラリー調製キット / 液体生検サンプル由来のcf-miRNAライブラリー調整キット / 参考文献 / Real-Seq® Size Select Beads / RealSeq®-AC Index Primers

RealSeq® は、次世代シークエンス(NGS)解析用の small-RNA ライブラリーの調製時バイアスを最小限に抑える独自の技術です。この技術は、多くの miRNA の検出不足につながる、ライブラリー調製時のバイアスの問題を解決します。本キットと他社製品を用いてライブラリー調製を行い、シークエンス結果のバイアスを比較した文献をはじめとする、多数の文献がございます。

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RealSeq®の特長

Small-RNA シークエンスライブラリーを調整する過程におけるほとんどのバイアスは、アダプターを miRNA/small-RNA の 3' および 5' 末端に接続することに起因します。RealSeq® は、単一アダプターとの環状化ライゲーション法を用いた独自の技術であり、ライブラリー調整時のバイアスを大幅に減少させます。


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<特長>
ライブラリー調製時のバイアスが大幅に減少
empty adapter/adapter dimer をほとんど形成しない
液体生検サンプルからRNAライブラリーをゲルフリーで調整することが可能
多種多様なmiRNA、その他の低分子RNAの検出が可能
堅牢なmiRNAの定量が可能

◆5つの異なる市販のライブラリー調整キットとバイアスを比較した結果

右図は、1pmoleのmiRXPloreユニバーサルリファレンスプール(Miltenyi Biotec)を使用して、6つの異なる市販のライブラリー調製キットのバイアスを比較した結果。
RealSeq®-ACは、他のキットよりもバイアスが大幅に低く、71.8%を正確に定量化している。

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◆本キットと他社製品を比較した参考文献

1. 本キットは、感度、解析結果の一貫性、バイアスの観点で、最も高いパフォーマンス(本キットと他社3製品を用いた比較)
Khamina, K. et al. A MicroRNA Next-Generation-Sequencing Discovery Assay (miND) for Genome-Scale Analysis and Absolute Quantitation of Circulating MicroRNA Biomarkers. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 1226. https://doi.org/10.3390/ijms23031226
2. 本キット(環状化ライゲーション)を除くライゲーションを用いた調整法では高いバイアス(4つの原理の10製品を用いた比較)
Herbert ZT. et al. Multisite Evaluation of Next-Generation Methods for Small RNA Quantification. J Biomol Tech. 2020 Jul;31(2):47-56. doi: 10.7171/jbt.20-3102-001
3. 本キットは、ライブラリー調整時のバイアスを低減し、低分子RNAの高精度検出、定量可能(本キットと他社5製品を用いた比較)
Barberán-Soler S. et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biol. 2018;19(1):105. Published 2018 Sep 3. doi:10.1186/s13059-018-1488-z


細胞、組織サンプル由来の miRNA ライブラリー調整キット

本キットを用いることで、細胞や組織中のmiRNAサンプル(1ng-1000ng total RNA input)から最低限のバイアスで Illumina 社の次世代シークエンサーに対応したライブラリーを調整可能です。

◆キット内容
試薬 チューブキャップカラー 保存温度
RNA Buffer(RB) Blue -20℃
RealSeq® Adapter(A) Blue -20℃
RNase Inhibitor(RI) Blue -20℃
Ligation Buffer(LB) Blue -20℃
Ligase(L) Blue -20℃
Blocking Agent(BA) Orange -20℃
Blocking Enzyme(BE) Orange -20℃
Blocking Buffer(BB) Orange -20℃
RealSeq® Enzyme(RSE) Green -20℃
RealSeq® Buffer(RSB) Green -20℃
RT Primer(RTP) Red -20℃
dNTPs(dNTP) Red -20℃
RT Buffer(RTB) Red -20℃
RT Enzyme(RTE) Red -20℃
PCR Buffer Yellow -20℃
PCR Polymerase Yellow -20℃
Dimer Removal Agent(DRA) - -20℃
Adapter Dilution Buffer(AD) - -20℃
miRNA Control(+) - -20℃
RNase-Free Water(W) - -20℃
Forward Primer(FP) - -20℃
Reverse Primers, Index 1(RP-12/24/48) - -20℃
RealSeq® Beads(B) - 4℃

◆その他準備しておくもの
・ヌクレアーゼフリーPCRチューブ
・ヌクレアーゼフリー1.5mlチューブ
・PCRチューブ用のマグネットスタンド
・96ウェルアルミニウムブロック
・RealSeq® Size Select Beads(カタログ番号 510-00012/510-00024/510-00048)*
・96-100%エタノール(分子生物学グレード)
・Bioanalyzer® DNA 1000キットまたは、Tape Station D1000 DNAキット
・Qubit® フルオロメーターおよびQubit® dsDNA HS アッセイキット、100アッセイ
*AMPure XP 磁気ビーズで代用していただけます。

◆ワークフロー


◆参考資料
RealSeq®-AC製品マニュアル

◆価格
製品名 容量 税別定価 Cat.#
RealSeq®-AC miRNA Library Kit for Illumina® sequencing 12 rxns お問合せ 500-00012
48 rxns お問合せ 500-00048


液体生検サンプル由来の cf-miRNA ライブラリー調製キット

血漿などの生体液中の cf-miRNA サンプルから最低限のバイアスで、Illumina社の次世代シークエンサーに対応したライブラリーを調整する様設計されています。わずか 50μL の血漿から得られるRNAをサンプルとして用いて、ゲルフリーのプロトコルにより、高感度で精度の高い解析が可能です。

◆3つの異なるライブラリー調整キットを使用した血漿miRNAのプロファイリングの結果

共通の血漿サンプルを使用して、3つの異なるライブラリー調製キットでシークエンスライブラリーを準備しました。すべてのヒトmiRNAを含むデータベース(miRBase)を使用してアラインされ、アラインされないリードは、さらにヒトゲノムデータベース(hg19)にアラインしました。本キットを使用することで参照配列にマッピングされるmiRNAおよびその他の低分子RNAの割合は大幅に多くなります。

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◆異なるライブラリー調製キットによる血漿miRNAの検出

健康なドナーからの200μLの血漿サンプルを使用して、3つの異なるライブラリー調製キットでシークエンスライブラリーを準備しました。シークエンシングカバレッジを正規化するために、リードは1,000万リードにサブサンプリングされました。シークエンシングリードは、miRBase 21 データベースにアラインされました。本キットを使用した場合、はるかに多い種類のmiRNAのシークエンスが可能であり、特にコピー数の少ないmiRNAでは顕著です(A)。また、サンプルを支配するmiRNAの割合からバイアスが少ない解析を本キットが可能にすることがわかります(B)。


(クリックすると拡大)

◆キット内容

試薬 チューブキャップカラー 保存温度
RNA Buffer(RB) Blue -20℃
RealSeq® Adapter(A) Blue -20℃
RNase Inhibitor(RI) Blue -20℃
Ligation Buffer(LB) Blue -20℃
Ligase(L) Blue -20℃
Blocking Agent(BA) Orange -20℃
Blocking Enzyme(BE) Orange -20℃
RealSeq® Enzyme(RSE) Green -20℃
RealSeq® Buffer(RSB) Green -20℃
RT Primer(RTP) Pink -20℃
dNTPs(dNTP) Pink -20℃
RT Buffer(RTB) Pink -20℃
RT Enzyme(RTE) Pink -20℃
PCR Buffer Yellow -20℃
PCR Polymerase Yellow -20℃
Dimer Removal Agent(DRA) - -20℃
HY4 Removal Agent(HY) - -20℃
miRNA Control(+) - -20℃
RNase-Free Water(W) - -20℃
Forward Primer(FP) - -20℃
Reverse Primers, Index(RP1-12/24/48) - -20℃
Reverse Primers, Index 25-48(RP25-48) - -20℃
RealSeq® Beads(B) - 4℃
SPRI Beads(SPRI) - 4℃

◆その他準備しておくもの
・ヌクレアーゼフリーのPCRチューブ
・ヌクレアーゼフリーの1.5mlチューブ
・PCRチューブ用のマグネットスタンド
・96ウェルアルミニウムブロック
・96-100%エタノール(分子生物学グレード)
・Bioanalyzer® DNA 1000 キットまたは、Tape Station D1000 DNA キット
・Qubit® フルオロメーターおよびQubit® dsDNA HS アッセイキット、100アッセイ

◆ワークフロー



◆参考資料
製品データシート
RealSeq®-Biofluids 製品マニュアル

◆価格
製品名 容量 税別定価 Cat.#
RealSeq®-Biofluids Plasma/Serum miRNA Library Kit
for Illumina® sequencing
12 rxns お問合せ 600-00012
48 rxns お問合せ 600-00048


参考文献


1. Liu, X. et al. A pro-metastatic tRNA fragment drives Nucleolin oligomerization and stabilization of bound metabolic mRNAs. Mol Cell. 2022 Jul 21;82(14):2604-2617.e8. doi: 10.1016/j.molcel.2022.05.008. Epub 2022 Jun 1.
2. Hacquard, T. et al. The Arabidopsis F-box protein FBW2 targets AGO1 for degradation to prevent spurious loading of illegitimate small RNA. Cell Rep. 2022 Apr 12;39(2):110671.doi:10.1016/j.celrep.2022.110671.
3. Karimi, H.Z. et al. Arabidopsis apoplastic fluid contains sRNA- and circular RNA–protein complexes that are located outside extracellular vesicles, The Plant Cell, Volume 34, Issue 5, May 2022, Pages 1863–1881, https://doi.org/10.1093/plcell/koac043
4. Carro Vázquez, D. et al. Effect of Anti-Osteoporotic Treatments on Circulating and Bone MicroRNA Patterns in Osteopenic ZDF Rats. International Journal of Molecular Sciences 23, 6534 (2022).
5. Zhou, X. et al. (2022), 24-nt phasiRNAs move from tapetal to meiotic cells in maize anthers. New Phytol, 235: 488-501. https://doi.org/10.1111/nph.18167
6. Vázquez-Villaseñor, I. et al. RNA-Seq Profiling of Neutrophil-Derived Microvesicles in Alzheimer’s Disease Patients Identifies a miRNA Signature That May Impact Blood-Brain Barrier Integrity. International Journal of Molecular Sciences 23, 5913 (2022).
7. Lattekivi, F. et al. Profiling Blood Serum Extracellular Vesicles in Plaque Psoriasis and Psoriatic Arthritis Patients Reveals Potential Disease Biomarkers. Int J Mol Sci 23, doi:10.3390/ijms23074005 (2022).
8. Ravishankar, P., and Daily A., Tears as the Next Diagnostic Biofluid: A Comparative Study between Ocular Fluid and Blood. Applied Sciences, 2022, 12(6), 2884; https://doi.org/10.3390/app12062884
9. Gutmann, C., et al., Association of cardiometabolic microRNAs with COVID-19 severity and mortality. Cardiovascular Research, Volume 118, Issue 2, February 2022, Pages 461–474, https://doi.org/10.1093/cvr/cvab338
10. Androvic, P., et al., Small RNA-Sequencing for Analysis of Circulating miRNAs: Benchmark Study. J Mol Diagn. 2022 Jan 23;S1525-1578(22)00011-3. doi: 10.1016/j.jmoldx.2021.12.006.


RealSeq®-Size Select Beads
本製品は、アダプターダイマーを取り除くためのサイズ選択ビーズです。

◆価格
製品名 容量 税別定価 Cat.#
RealSeq® Size Select Beads 12 rxns お問合せ 510-00024
48 rxns お問合せ 510-00048
※ライブラリー調製キットと同時購入時の価格です。


RealSeq®-AC Index Primers

本製品は、RealSeq®キットに含まれるプライマーに加えて、オプションのインデックスプライマーです。

◆価格
製品名 Index 税別定価 Cat.#
RealSeq®-AC Index Primers 1-12 お問合せ 501-00024
13-24 お問合せ 502-00024
25-36 お問合せ 503-00024
37-48 お問合せ 504-00024
※ライブラリー調製キットと同時購入時の価格です。

お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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