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Home製品・サービス情報試薬・材料・消耗品>DiaCarta社製 ゲノム編集で作成した変異体のスクリーニングキット(研究用) CRISPR-Quest Gene-Editing Event Screening Kit

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CRISPR-Quest Gene-Editing Event Screening Kit

本製品は、ゼノ核酸(XNA)テクノロジーを使用して、CRISPR/CAS9ゲノム編集技術により作成された変異体をスクリーニングします。予想される変異部位をカバーする野生型遺伝子配列をカスタムXNAとして選択的にデザインします。カスタム合成されたXNAは、qPCR反応において、野生型配列増幅を抑制し、変異配列を含有するDNAを選択的に増幅します。このスクリーニング方法は、選択されたプールからの変異体をスクリーニングするために、または所望の変異を含む個々のクローンをスクリーニング/確認するために使用されます。変異DNAは、サンガー法によって配列決定することが可能です。この方法は、ガイドRNAおよび変異クローンのハイスループットスクリーニングに特に有効です。

以下の例は、WTAP遺伝子のXNAデザインを示しています。設計に使用したXNA配列、PAM配列および切断部位を以下に示します。



変異体をスクリーニングし、さらにサンガー法を用いて変異体をシークエンシングするためのプライマーおよびXNAを設計するのに役立つ情報が必要です。ゲノム編集変異スクリーニングに使用されるXNAデザインについては、お問合せください。


【XNAスクリーニングの機能】

CRISPRゲノム編集後の典型的な非相同性末端結合(NHEJ)変異体スクリーニングプロセスでは、ポジティブコントロール(野生型DNA+プライマー、XNAなし)、ネガティブコントロール(野生型DNA+プライマー、XNA付き)およびサンプルDNA(細胞プールまたは個々のクローン由来)を用いて、SYBRgreen qPCRを行うことができます。
ヌクレオチド置換または忌んでるによる変異体の増幅プロットは、下図に示す様に、ポジティブコントロールとネガティブコントロールのプロットの間に位置します。変異が存在しない場合、サンプル増幅プロットは、ネガティブコントロールプロットと同様になります。



変異体のCq値とポジティブコントロールのCq値の差(ΔCq)に基づいて、編集された細胞の割合のパーセンテージはおおまかに推定できますが、正確ではありません。

 編集率 %=2-ΔCq×100%

例えば、ポジティブコントロールのCqが25サイクルで、変異体のCqが27サイクルの場合、ΔCqは2、編集率は25%です。しかし、変異スクリーニングまたはgRNAスクリーニングでは、各サンプルのCq値と野生型のCq値を直接比較することで、使用した3または4つのgRNAのうち、どのgRNAがより効果的に機能するかについての手がかりが得られます。


【CRISPRにより、特定の遺伝子変異を含む安定細胞株を容易に作成】

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)システムによるゲノム編集は、遺伝子変異の創出に革命をもたらしました。研究コミュニティーが急速にCRISPR/Cas9テクノロジーを受け入れたことで、ゲノム編集は分子生物学実験質の日常業務となっています。CRISPRを使用して、遺伝子ノックアウト変異を作成することは、あらゆる関心のある遺伝子に対して非常に簡単です。従来の遺伝子ノックアウトおよびsiRNAまたはshRNAのノックダウン技術は、これ以上必要ありません。


【CRISPRゲノム編集からの所望の変異体のスクリーニングに対する課題】

CRISPRシステムを使用することにおける最大の課題の1つは、このシステムの導入から所望の変異を有するクローンの同定までに時間がかかるということです。これは、現在の技術効率が低いことや、遺伝子破壊メカニズムの性質に起因する可能性があります。
ガイドRNA(gRNA)およびCas9システムでのトランスフェクション後、可能性のある変異を有する細胞または細胞クローンは、抗生物質選択またはレポーター遺伝子発現選別のいずれかを用いて、選択または濃縮されます。真の課題は、野生型配列を有するクローンの大部分から、低パーセンテージの目的の変異体を含むクローンを選択することです。


【変異スクリーニングのためのXNAテクノロジーの利用】

XNAは、他のテクノロジーと比較して、CRISPRゲノム編集後の変異クローンのスクリーニングに最適な選択肢です。ゲノム編集は、1%未満の頻度で起こるため、通常のPCR法は大部分の野生型バックグラウンドにおける変異体を同定することができません。
XNAテクノロジーは、変異が点変異かインデル変異であるかどうかに関わらず、予想される変異部位で野生型配列を抑制することにより、Cas9ゲノム編集システムによって作られた変異体を選択的に検出することができます。プールDNAに変異型DNAが存在していれば、約3時間のqPCR反応で同定することができます。
また、変異クローンの同定に加えて、この技術はガイドRNA効率の経験的検証および標的遺伝子座における「相同組換修復(HDR):非相同末端結合(NHEJ)」の比の測定も可能です。



【サポートデータ】

qPCRの結果

一塩基変化を有する希少細胞は、測定ツールとしてXNAテクノロジーを使用して単離され、次いで純粋なクローンが得られるまで順次濃縮します。
・修飾率の計算

アンプコンシークエンシングおよびT7EIと比較して有利です。T7EIが失敗する可能性がある小さな変異およびSNPに有用です。高い%の修飾混合物でよりよく機能します。これは、ハイスループットの修飾ワークフローやクローンスクリーニングに役立ちます。

- CRISPR-Quest
BioRad/Taq
CRISPR-Quest
NEB
アンプリコン
シークエンシング
T7
エンドヌクレアーゼ
トランスフェクトプール 21% 15% 26.5% 20%
単離株B 62% 50% - -
単離株F 99% 95% 92.6% 7.5%
HEK-295 0% 0% - -
Jurkat 0% 0% - -


【価格】

製品名 サイズ 税別価格 カタログ#
CRISPR-Quest Gene-Editing Event Screening Kit 500反応分 ¥624,000 DC-70-0500R
1000反応分 ¥919,000 DC-70-1000R


注意事項


本キットは、研究用として販売しております。ヒト、動物への医療・臨床診断用には使用しない様にご注意ください。また、食品・化粧品・家庭用品などとして、使用しないでください。
無断で承認を得ず、製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。

お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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