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GeneFirst 社製品
cfDNA NGS ライブラリー調製キット
がん関連リアルタイムPCRキット
ATOMSeqとは? / XCeloSeq cfDNA Library Prep Kit / XCeloSeq Pan Cancer Kit / OncoPlex Mutation Test Kit / Papilloplex HPV

GeneFirst社は、特許取得済みの新しいテクノロジー ATOMSeq® を使用し、cfDNAなどを対象とした次世代シークエンス用のライブラリー調製キットを販売しています。その他にもがん関連のマルチプレックス変異検出を目的としたリアルタイムPCRベースのキットも開発中です。


ATOMSeq®とは?


ATOMSeq®とは、「
Adaptor Template Oligo Mediated Sequencing」 の略です。

【ATOMSeq® の特長】
ATOMSeq® は、PCRやライゲーションに依存しないアプローチを使用して、非常に高い効率でDNAサンプルの3'末端に直接、独自の分子識別子(UMI)を追加することができます。これにより、サンプル中のDNAの変異を超高感度で検出します。リキッドバイオプシーで解析対象となる ctDNA や cfDNA に加えて、一本鎖または二本鎖の断片化されたゲノムDNA、FFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋)組織由来のDNAにも対応しています。



【ATOMSeq® の利点】
・リキッドバイオプシーにおいて、超高感度で変異の検出が可能
・競合製品と比較して迅速なプロトコル
・ビーズ精製が少なくて済む高いサンプル保持力
・センス鎖とアンチセンス鎖をUMIにより独立して識別するため、変異解析の感度と信頼性が向上
・全てのDNA鎖をターゲットとするため、未知のDNAの検出が可能
・UMIが直接追加されるため、ポリメラーゼによるバイアスを回避
・UMIにより、エラー修正可能であり、インデックスホッピングを回避


XCeloSeq cfDNA Library Prep Kit


本キットは、cfDNA、断片化されたgDNA、FFPE組織由来のDNAなどを対象とし、次世代シークエンサー(Illumina)での使用に適した高品質ライブラリーを調整することが可能です。

【XCeloSeq cfDNA Library Prep Kit を用いたライブラリー調整後のDNAフラグメント解析の結果】

▲QiAMP MinElute cfDNA 抽出キット(QIAGEN)を使用して凍結したヒト血漿から抽出した4ng cfDNA を用いてライブラリーを調整した結果。 ▲酵素により200~300bpに断片化し、バイサルファイト処理したgDNAを用いてライブラリー調製した結果。
断片化され、損傷したDNAにも対応可能 !!

【XCeloSeq cfDNA Library Prep Kit を用いたライブラリー調整後のDNAフラグメント解析の結果】

- 試薬 内容物
1 ATO-1 Adaptor Template Oligo 1
2 ATO Reagents dNTPs/buffer
3 ATO Enzyme Proprietary DNA Polymerase
4 ATO Treatment Proproetary Enzyme
5 Amplification Primers DNA oligos
6 Universal Enzyme Mix Proprietary 2x Master Mix
7 ATO Purification Beads Proprietary purification beads
8 ATO-2 Adaptor Template Oligo 2


【その他の準備しておくもの】
・検体採取、ろ過、核酸抽出用の試薬と機器
・蒸留水(分子生物学グレード)
・100%エタノール(分子生物学グレード)
・DNaseおよびRNaseフリーのエアゾールバリア付きピペットチップ
・反応ミックスを調整するためのDNaseおよびRNaseフリーのチューブ
・Agencourt® AMPure® XP 磁気ビーズ
・適切なマグネットプレート(Thermo Fisher Scientific, Magnetic Stand-96, AM10027, その他の適切な代替品)
・調整可能なピペット(P10、P20、P200およびP1000、または同様のもの)
・ボルテックスミキサー
・マイクロ遠心機
・標準PCRサーマルサイクラー
・PCRチューブ、プレート
・氷

【参考資料】

【価格】
製品名 容量 税別定価 Cat.#
XCeloSeq cfDNA Library Prep Kit 8 rxns ¥130,000 SEQ001
※本キットに含まれるIndexは、1種類となっているので、追加のIndexの購入を希望される場合はお問合せください。


XCeloSeq Pan Cancer Kit


本キットは、優れた性能を有するリキッドバイオプシーベースの腫瘍プロファイリングアッセイです。570を超える領域をターゲットにすることで、100遺伝子にわたって4000を超える変異を検出できる様に設計されたがんパネルです。20ngのDNAで0.1%のAllele Frequency(AF)検出につながる高いキャプチャー効率を有します。

【ターゲット遺伝子】
ABL1 BRCA1 CHEK2 ESR1 GNAQ KEAP1 MSH2 NTRK3 RHOA SMO
AKT1 BRCA2 CSF1R EZH2 GNAS KIT MSH6 PDGFRA RLT1 SRC
ALK CASP8 CTNNB1 FBXW7 HNF1A KLF5 MTOR PIK3CA RNF43 STK11
AMER1 CCND1 DDR2 FGFR1 HRAS KRAS MYC PTCH1 ROS1 TCF7L2
APC CCND2 DMD FGFR2 IDH1 MAP2K1 NF1 PTEN SETD2 TP53
AR CCND3 EGFR FGFR3 IDH2 MAP2K2 NFE2L2 PTPN11 SF3B1 TSC1
ARAF CDH1 EP300 FGFR4 JAK2 MET NOTCH1 RAF1 SMAD2 TSC2
ARID1A CDK4 ERBB2 FLT3 JAK3 MGA NPM1 RB1 SMAD4 UA2F1
ATM CDK6 ERBB3 GATA3 KDM6A MLH1 NRAS RBM10 SMARCA4 VHL
BRAF CDKN2A ERBB4 GNA11 KDR MPL NTRK1 RET SMARCB1 ZFP36L2

【20の肺がんFFPEおよびcfDNAサンプルを用いた臨床試験の結果】


▲サンプルから検出された変異数とその変異頻度を示しています。

【XCeloSeq Pan Cancer Kit のプロトコルの概要】

- 試薬 内容物
1 ATO Adaptor Template Oligo
2 ATO Reagents dNTPs/buffer
3 ATO Enzymer Proprietary DNA Polymerase
4 Amplification One Mix Proprietary 2x Master Mix
5 Primers DNA Oligos
6 Master Mix Proprietary 2x Master Mix
7 Pool1-OUTER DNA-Oligos enriching for sense DNA strand
8 Pool1-INNER DNA Oligos enriching for sense DNA strand
9 Pool2-OUTER DNA Oligos enriching for antisense DNA strand
10 Pool2-INNER DNA Oligos enriching for antisense DNA starand


【その他の準備しておくもの】
・検体採取、ろ過、核酸抽出用の試薬と機器
・蒸留水(分子生物学グレード)
・TEバッファー(10mM Tris-HCL、1mM EDTA;分子生物学グレード)
・100%エタノール(分子生物学グレード)
・DNaseおよびRNaseフリーのエアゾールバリア付きピペットチップ
・DNaseおよびRNaseフリーのチューブ
・Agencourt® AMPure® XP 磁気ビーズ
・適切なマグネットプレート(Thermo Fisher Scientific, Magnetic Stand-96, AM10027, その他の適切な代替品)
・調製可能なピペット(P10 、P20、P200およびP1000、または同様のもの)
・ボルテックスミキサー
・マイクロ遠心機
・標準PCRサーマルサイクラー
・PCRチューブ、プレート
・氷

【参考資料】

【価格】
製品名 容量 税別定価 Cat.#
XCeloSeq Pan Cancer Kit 8 rxns ¥392,000 SEQ002
※本キットに含まれるIndexは、1種類となっているので、追加のIndexの購入を希望される場合はお問合せください。


OncoPlex(MMD-PCR technology) Mutation Kit


OncoPlexは、独自の技術であるMMD-PCR(Multiplex Mutation Detection PCR)を用いて、様々なサンプルのDNA中の癌関連変異を検出することが可能なRT-PCRベースのテクノロジーです。


MMD-PCRは、特別に設計された変異特異的プライマー、ブロッカープローブ、および特殊なPCRサイクル条件を組み合わせることによって、変異型対立遺伝子を含むPCR産物の選択的増幅を促進すると同時に正常遺伝子の増幅をブロックします。これにより、正常遺伝子の高いバックグラウンドに対する稀な変異を検出することができます。多くの腫瘍がその遺伝物質の一部を血流に放出するため、非常に高い感度でOncoPlexキットは血液サンプル中の癌性変異の検出に使用できます(低コピー数の変異の検出 1%から0.1%まで)。

(キット内容)
試薬名 内容物
Master Mix GeneFirst enzyme and buffer mix
Working Mix Primers and probes
Negative control Wild type human control DNA(ROX)
Positive control positive control DNA(FAM)

▲MMD-PCRアッセイを使用して通常遺伝子バックグラウンドに対して検出された変異の結果。緑色の増幅曲線はターゲットの増幅を示し、赤の増幅曲線は内在性コントロールの増幅を示します。

【OncoPlex® EGFR Mutation Test Kit】

本キットは、EGFR遺伝子の複数の変異を4つのチューブで検出することが可能です。


▼EGFR-MMD-PCR MiXAを用いて
1%のT790M変異を検出した結果


▼EGFR-MMD-PCR MixBを用いて
1%のG719A変異を検出した結果

Mutation Base Change Fluorescence Channel Reaction Mix
T790M (exon 20) 2369C>T HEX A
G719C (exon 18) 2155G>T HEX
L861Q (exon 21) 2155G>T HEX B
G719S (exon 18) 2155G>A HEX
G719A (exon 18) 2156G>C HEX
Exon 20 insertion 2307_2308insert 9 bases FAM C
Exon 20 insertion 2310_2311insert GGT FAM
Exon 20 insertion 2319_2320insert CAC FAM
S768I (exon 20) 2303G>T FAM
L858R (exon 21) 2573T>G FAM D
Exon 19 deletions All deletions FAM

(参考資料)
 ・OncoPlex® EGFR Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex
® KRAS Mutation Test Kit】

本キットは、23のk-ras変異を6つのチューブで検出することが可能です。


▼KRAS-MMD-PCR MiXAを用いて
1%Gly12Arg変異を検出した結果


▼BRAF-MMD-PCR MixBを用いて
1%Gly13Asp変異を検出した結果

Mutation Base Change Fluorescence
Channel
Reaction
Mix
G12A CGT>GCT HEX A
G12C GGT>TGT HEX
G12D GGT>GAT HEX
G12R GGT>CGT HEX
G12S GGT>AGT HEX
G12V GGT>GTT HEX
G13D GGC>GAC HEX B
A59E GCA>GAA HEX C
A59G GCA>GGA HEX
A59T GCA>ACA HEX
Q61E CAA>GAA FAM D
Q61H CAA>CAC FAM
Q61H CAA>CAT FAM
 Q61K CAA>AAA  FAM
Q61L CAA>CT FAM
Q61P CAA>CC FAM
 Q61R CAA>CG FAM
K117N  AAA>AAC FAM E
K117N AAA>AAT FAM
A146G GCA>GGA FAM F
A146P GCA>CCA FAM
A146T GCA>ACA FAM
A146V GCA>GTA FAM

(参考資料)
 ・OncoPlex® KRAS Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex® BRAF Mutation Test Kit】

本キットは、b-raf遺伝子のV600E、V600D、V600K、V600R変異を検出することが可能です。


▼BRAF-MMD-PCR を用いて変異を検出した結果


Mutation Base Change Fluorescence
Channel
V600E GTG>GAG FAM
V600E GTG>GAA FAM
V600D GTG>GAT FAM
V600K GTG>AAG FAM
V600R GTG>AGG FAM

(参考資料)
 ・OncoPlex® BRAF Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex® JAK2 Mutation Test Kit】

本キットは、jak2遺伝子のV617F変異を検出することが可能です。


▼LAK2-MMD-PCR を用いてV617F変異を検出した結果


Mutation Base Change Fluorescence
Channel
V617F GTC>TTC FAM

(参考資料)
 ・OncoPlex® JAK2 Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex® ABL Mutation Test Kit】

本キットは、BCR-ABL1遺伝子のT315I 変異を検出することが可能です。


▼ABL-MMD-PCR を用いてT315I 変異を検出した結果


Mutation Base Change Fluorescence
Channel
T315I (exon 6) 944C>T FAM

(参考資料)
 ・OncoPlex® ABK Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex® PIK3CA Mutation Test Kit】

本キットは、PIK3CA遺伝子のE542K、E545K、E545D、H1047R 変異を検出することが可能です。


▼PIK3CA-MMD-PCR を用いて
1%E545K変異を検出した結果


Mutation Base Change Fluorescence
Channel
E542K (exon 9) 1624G>A FAM
E545K (exon 9) 1633G>A FAM
E545D (exon 9) 1635G>T FAM
H1047R (exon 20) 3140A>G HEX

(参考資料)
 ・OncoPlex® PIK3CA Mutation Test Kit マニュアル

【OncoPlex® HRAS Mutation Test Kit】

本キットは、HRASの15の変異を6つのチューブで検出することが可能です。


▼HRAS-MMD-PCR を用いてHRAS変異を検出した結果


Mutation Fluorescence
Channel
Reaction
Mix
Q61R HEX A
G13D FAM
Q61H FAM B
Q61L FAM
Q61K FAM
G12C FAM C
G13V FAM
G13R FAM
G12D FAM
G12R FAM D
G13S FAM
G12A FAM E
G13C FAM
G12S FAM F
G12V FAM
(参考資料)
 ・OncoPlex® HRAS Mutation Test Kit マニュアル

【価格】
製品名 容量 税別定価 Cat.#
OncoPlex® EGFR Mutation Test Kit 24 rxns ¥212,000 MMD001
OncoPlex® KRAS Mutation Test Kit 24 rxns ¥217,000 MMD002
OncoPlex® BRAF Mutation Test Kit 24 rxns ¥181,000 MMD003
OncoPlex® JAK2 Mutation Test Kit 24 rxns ¥150,000 MMD004
OncoPlex® ABL Mutation Test Kit 24 rxns ¥129,000 MMD005
OncoPlex® PIK3CA Mutation Test Kit 24 rxns ¥154,000 MMD006
OncoPlex® HRAS Mutation Test Kit 24 rxns ¥219,000 MMD008


Papilloplex HPV (MPA-PCR technology)

Multiplex Probe Amplification (MPA) テクノロジーは、マルチプレックスのリアルタイムPCRの制限を克服し、蛍光チャネルごとに最大6つの異なるターゲットの識別を可能にします。本キットは、複数のHPV(Human papilloma virus)遺伝子型の検出や識別が可能です。

MPA-PCRキットには、複数のターゲット用のPCRプライマーとプローブ、各プローブに部分的に相補的なオリゴヌクレオチドが含まれています。リアルタイムPCRが実行され、ターゲットが存在する場合、対応するプローブは増幅段階で消費されます。未使用プローブの解離曲線解析を増幅段階の後に実行します。各プローブと部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの複合体は、異なる融解温度をもっています。プローブ自体の特徴的な融解プロファイルのピークがないことにより、増幅段階でどのプローブが消費されたかを測定することができ、どの遺伝子型のHPVが開始サンプルに存在するかを決定することが可能です。

(利点)
単一チューブでターゲットの多重検出と識別が可能
ハイスループットな解析により、時間と試薬コストの削減が可能
一般的に使用されるRT-PCRプラットフォームと互換性がある

▲FAMチャネルの融解曲線プロファイル。赤い線は、ネガティブコントロールを示し、緑の線はテストサンプルを示します。融解曲線の違い(灰色の円で表示)により、テストしたサンプルに存在するHPV遺伝子型を識別できます。
(キット内容)
試薬名 内容物
Buffer Mix Mg2+, dNTPs
Enzyme Mix Taq Polymerase, UNG enzyme, dUTP
Working Mix Primers and probes
Negative control TE Buffer
Positive control Control DNA

【Papilloplex® High Risk HPV】

本キットは、尿検体から抽出したDNAを用いて14の高リスク Human Papillomavirus(HR HPV)遺伝子型を同時に検出、識別することが可能です。各遺伝子型のHR、HPVの融解曲線は製品マニュアルをご確認ください。

HR HPV 遺伝子型:
16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68


▲HR HPV16とHR HPV31を用いたテストデータ。緑の線はネガティブコントロールを示し、赤の線は各テストサンプルを示します。

(交差反応性のテスト結果)
下記の試験対象(30,000 copies/reaction)でテストした結果から、本キットは HR HPV にのみ特異的であることが立証されました。

(試験対象)
他の遺伝子型: 6, 10, 11, 26, 30, 32, 34, 40, 53, 54, 57, 61, 67, 69, 70, 73, 82, 85, 90, 97
臨床サンプル中に存在すると予想される非HPV:
Lactobacillus acidophilus, Candida albicans, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis C-1, Garnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis Serovar E, Human herpes virus 2, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae

(参考資料)
 ・Papilloplex® High Risk HPV マニュアル

(価格)
製品名 容量 税別定価 Cat.#
Papilloplex® High Risk HPV 96 rxns ¥211,000 MPAHPV001

お問い合わせ 試薬部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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