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PEPperPRINT社製 ペプチドマイクロアレイ
PEPperMAP® Peptide Microarray 受託解析サービス
サービス内容 / 解析アプリケーション / サンプル条件 / 納品データ・価格 / ご注意事項

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本サービスは、PEPperPRINT社の包括的なペプチドマイクロアレイを使用した受託解析サービスです。
抗体のエピトープ解析や、自己免疫/がん研究、抗体医薬品の研究開発など、様々な用途に利用することができます。
本解析に使用するアレイは、独自の合成技術を採用しており、膨大な数のペプチドをアレイ上に直接プリントしています。アレイには、ご要望に合わせてカスタム作製するものや、研究目的に合わせてご選択いただけるレディーメイドのものなど、様々なマイクロアレイをご用意しており、アレイ解析の高度な専門知識や、スキャナー等の解析装置が無くとも、ペプチドアレイ解析をスムーズに実施することができます。

【関連製品】
PEPperCHIP® Standard Peptide Microarrays/PEPperCHIP® Accessories
PEPperCHIP® Custom Peptide Microarrays


サービス内容


本サービスでは、お客様の解析したい抗体、タンパク質などに合わせてカスタムでマイクロアレイを作製し、ご提供いただいたサンプルで解析まですべて実施いたします。(PEPperPRINT社で販売されているマイクロアレイを使用した解析にも対応しています。)

◆アレイの特長
独自のOn-Chip合成技術(PEPperCHIP® Platform Technology)*で作製したマイクロアレイを使用したサービス
ハイスループットスクリーニング
アレイレイアウトやサブアレイ数、搭載ペプチドのデザインなどのカスタマイズが可能
コントロールペプチドとしてHA(YPYDVPDYAG)およびFlag(DYKDDDDKAS)を採用
カスタムガラスコーティングによる優れたS/N比を実現

◆アレイの種類

本サービスでは、スタンダードとディスカバリーの2種類のアレイフォーマットをご用意しています。ディスカバリーフォーマットは、サービスのみのご提供となりますが、スタンダードフォーマットはスライド単体での販売も行っています。

【スタンダードフォーマット】
PEPperCHIP® Custom Peptide Microarrays: 最大5,500ペプチドをデュプリケートで搭載可能なカスタムアレイ
PEPperCHIP® Standard Peptide Microarrays: 感染症やがん、自己免疫研究用にデザインされたマイクロアレイ。

【ディスカバリーフォーマット】
・PEPperCHIP® Discovery peptide Microarray: 最大35,000のペプチドをデュプリケートで搭載可能な大規模解析用のカスタムアレイ。

◆サービスワークフロー
1. カスタムペプチドアレイの作製
タンパク質のアミノ酸配列情報またはペプチドコレクション情報に基づき、カスタムペプチドマイクロアレイの製造を行います。
2. マイクロアレイのハイブリダイゼーション
ご提供頂いた抗体、血清/血漿、あるいは精製標的タンパク質サンプルと、その二次抗体によるイムノアッセイ、抗Flag抗体および抗HA抗体を用いたコントロールアッセイなどを行います。
3. ペプチドアレイのスキャンニングおよびデータ読み取り
マイクロアレイスキャナーを用いて、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイを読み取ります。
4. データの定量化および評価
専用解析ソフトウェア PeptideSlide® Analyzer を用いて、スキャン画像に基づくデータ定量化、データ評価、最終レポートを作成します。

◆テクニカルレター
CDI社製プロテインアレイとPEPperPRINT社製ペプチドアレイを組み合わせた、抗体のバリデーションと抗原探索 


解析アプリケーション


本サービスでは、ペプチドアレイを使用した様々なアプリケーションをご用意しています。
リニアエピトープマッピング / 立体配座エピトープマッピング / エピトープ置換スキャン / 抗原とエピトープの同時探索 / 免疫モニタリング / 血清バイオマーカー探索 / ペプチドターゲットバインダー開発

◆リニアエピトープマッピング
本アプリケーションでは、抗体および血清サンプルの高解像度マッピングによるエピトープの同定が可能です。抗原となるペプチド配列を一定のオーバーラップペプチドに変換してマイクロアレイ上にプリントします。アレイスライド上に15aaのペプチド鎖長で14aaのオーバーラップペプチド(1シフト)をプリントすることで高解像度なエピトープ解析を実現しています。搭載されるペプチドは全て直鎖状でプリントされ、作製されたペプチドアレイと抗体または血清、それに対する二次抗体をインキュベートすることで、エピトープと関連するスポットパターンを取得します。なお、ご希望に合わせてペプチド鎖長、オーバーラップ長などをカスタマイズすることもできます。



【解析例】
15aaのペプチド鎖長、14aaオーバーラップペプチドを搭載した最もベーシックなアレイ構成で抗原ペプチドに対するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行った結果です。マイクロアレイのスキャンニング(左)および強度プロット(右)は、抗体のエピトープを表すコンセンサスモチーフに隣接するペプチド範囲を明らかにしました。染色されたHA(赤)とFlag(緑)のコントロールペプチドは抗原由来ペプチドを囲む様に配置されています。



以下は、3種のペプチド長(10aa、12aa、15aa)をそれぞれ1シフトさせたオーバーラップペプチドで応用的なエピトープ解析を行った結果です。ポリクローナル抗体中で隣接しているエピトープの分離や抗体の結合に対するペプチド長の影響も解析できます。マイクロアレイのスキャンニング(左)と強度プロット(右)の結果において、15aaは見かけ上1つのエピトープを示していますが、10aaおよび12aaでは2つの隣接エピトープを示しています。染色されたHA(赤)とFlag(緑)のコントロールペプチドは、抗原由来ペプチドを囲む様に配置されています。




◆立体配座エピトープマッピング
治療用抗体はしばしば立体配座エピトープに結合するため、直鎖ペプチドでのマッピングが困難となる場合があります。この様な場合は、強制環状ペプチド(Constrained Cyclic peptides)を用いることで、エピトープのループ構造を模倣し、問題を解決します。
抗原特異的な強制環状ペプチドを使用することで、モノクローナル抗体の高解像度な立体配座エピトープを実現しています。ペプチドは通常チオエーテル環化反応を利用してN末端とC末端の環状化を行っていますが、ご希望があれば、ジスルフィド結合を利用したSS環状ペプチドとしてプリントすることも可能です。ただし、ジスルフィド結合で環化を行う場合は、ペプチド内部にシステインが含まれていないことが条件となります。含まれている場合は、システインはセリンに置換した状態でペプチドのデザインが行われます。
高解像度な立体配座エピトープ解析を実施するため、通常は標的抗原配列を、7aa、10aa、13aaの3パターンのペプチド鎖長(それぞれ6aa、9aa、12aaのオーバーラップペプチド)に変換され、異なるループサイズを模倣して解析が行われます。

【解析例】
以下は、強制環状ペプチド(左上)と直鎖ペプチド(左下)に翻訳されたCD20の細胞外ドメインを搭載したアレイの解析結果です。最初の2行は、7aaペプチドに、2番目、3番目はそれぞえ10aaおよび13aaペプチドに相当します。このアレイを100μg/mL リツキシマブと反応させ、anti-human IgG(赤)とanti-Flag(緑)で染色することでアッセイしています。直鎖ペプチドでは、リツキシマブに対する反応が示されていませんが、強制環状ペプチドではエピトープが検出されています。ペプチドアレイを囲んでいるFlagコントロールペプチドは、予測されたスポットパターンを示しています。



また、応用的な方法として、以下の「◆エピトープ置換スキャン」を組合せて、強制環状エピトープまたはペプチドの全アミノ酸部位を20アミノ酸(非天然型アミノ酸もオプションとして用意)で段階的に置換することも可能です。これにより、立体配座エピトープにおける保存または可変アミノ酸部位の同定、交差反応性の解析、またはエピトープ配列データに基づく治療用抗体に対するレスポンダーおよびノンレスポンダーの同定などの解析を行うことが可能です。

◆エピトープ置換スキャン
本アプリケーションでは、特定のエピトープあるいはすべてのペプチド配列のアミノ酸部位を置換して解析を行う方法で、エピトープにおける保存および可変アミノ酸領域の同定やエピトープ変異体または新規ミモトープの同定、抗体の選択性・交差反応性、またはペプチドワクチン・ペプチドバインダーの開発等の研究に利用できます。1残基または2残基ずつペプチドのアミノ酸を置換して解析を行うことが可能です。通常は単一置換スキャンで解析を実施しますが、ご希望に合わせて二重置換で解析を実施することも可能です。

【解析例】
この解析では、目的ペプチドの全アミノ酸を段階的に1残基ずつ、20種ある天然型アミノ酸に置換して解析します。オプションとして、非天然型アミノ酸(D-アミノ酸やシトルリン等)と置換することも可能です。
以下は、デュプリケートで搭載した12aaペプチドの単一置換の解析結果です。マイクロアレイはスキャニング(左上)後、ヒートマップ(左下)に変換され、典型的な置換パターンを示しています。アミノ酸プロットは野生型エピトープのアミノ酸置換時の強度の変化を示しています。12個のアミノ酸のうち7個が置換に対する限定的な反応を示しており、高度に保存されている部位であることが示唆されています。染色されたHA(赤)とFlag(緑)のコントロールペプチドは抗原由来ペプチドを囲む様に配置されています。



単一置換による段階的置換とは対照的に、一度に2つのアミノ酸を同時に置換することでエピトープ変異体、または新規ミモトープのハイスループットスクリーニングを行うことも可能です。数万のペプチド変異体を一度にアッセイし、ペプチドワクチンやペプチドミモトープ、ペプチドバインダーの発見、開発、最適化に利用することができます。
以下は、デュプリケートで搭載した11アミノ酸ペプチドの二重置換の解析結果です。この例では、ハイスループットなペプチド変異体の同定およびその最適化のために、ディスカバリーフォーマットのアレイに26,400の異なるペプチドが搭載されています。染色されたHA(赤)とFlag(緑)のコントロールペプチドは、抗原由来ペプチドを囲む様に配置されています。



◆抗原とエピトープの同時探索
本アプリケーションは、抗原およびエピトープをシングルステップで発見するプラットフォームです。膨大な数のペプチドをプリント可能なディスカバリーフォーマットを使用し、一度に300以上の抗原をオーバーラップペプチドに変換・プリントしてスクリーニングします。抗原ライブラリーの数が少ない場合は、スタンダードフォーマットによる解析も可能です。

【解析例】
下図は、関心のある334種類のタンパク質を10aaがオーバーラップした15アミノ酸のペプチドに変換した26,463ペプチドをデュプリケートでアレイにプリントした結果です。まず、1000倍希釈したプールコントロール血清でアッセイし(左上)、次に同じ倍率で希釈したプール患者血清でアッセイ(右上)した結果、多数の抗原およびエピトープが患者血清でのみ染色されました。血清数を増やして検証する為に、変動の大きかった抗原およびエピトープを選択(右下)、左はHA(赤)およびFlag(緑)のコントロールペプチドの染色結果を示しています。



◆免疫モニタリング
本アプリケーションは、免疫やワクチン接種、バイオ医薬品の糖よにおける抗体反応を解析することで、単一の抗原に対する抗体の存在の有無を検出するELISAとは対照的に、体液性免疫応答からエピトープを高免疫原性と低免疫原性に分類することができます。
オーバーラップペプチドに変換された単一または複数のタンパク質を搭載したペプチドマイクロアレイを免疫前サンプルでアッセイ化し、続いて同じアレイを用いて免疫後サンプルをアッセイするため、各個体の抗体反応の上昇を明確に区別することが可能です。さらに、異なるタイムポイントで取得された血清サンプルでは、免疫後やワクチン接種または薬剤投与後の体液性免疫応答の経時的変化の観察が可能です。
ワクチンとアジュバンドの開発や予防接種効果のフィンガープリント解析、ワクチン接種または抗薬物抗体のモニタリングなど、様々な解析に利用することが可能です。

【解析例】
下図は、13aaのペプチド鎖長で12aaのオーバーラップペプチドに変換した単一抗原をデュプリケートでプリントした解析結果です。免疫前(pre-immunization)の血清と反応させたアレイと一次免疫(First immunization)、および二次免疫(Second immunization)を比較すると免疫後に体液性免疫応答が増強しており、それらの強度プロットは、抗体の結合が経時的に増強することを示しています。



◆血清バイオマーカー探索
非侵襲的な方法で重篤な疾患の早期バイオマーカーを同定することは非常に重要ですが、一方でその条件が厳しくなります。この点において、多数のペプチドを搭載するマイクロアレイは、血清を用いた抗体バイオマーカーの発見にとって効果的なツールとなります。このアプリケーションにおけるプラットフォームの柔軟性により、例えば35,000種類のペプチドを、バイオマーカーの候補探索からバリデーション用ペプチドへの絞り込みまで段階的にスクリーニングすることができます。



◆ペプチドターゲットバインダー開発
ペプチドアレイは、ペプチドターゲットバインダーの開発に関して、ペプチドディスプレイスクリーン(mRNAディスプレイやファージディスプレイ、CISディスプレイなど)を補完します。最大1013のペプチドディスプレイスクリーンは、ペプチドライブラリーサイズの点で優れており、最適なスタートポイントを提供します。ディスプレイスクリーンでは、取得されるペプチド候補が数百・数千になることがあるため、第二のスクリーニング法によってバリデーションする必要があります。面倒で高価なELISAによるスクリーニングとは対照的に、一枚で数千のペプチド候補を一度にバリデーションすることが可能です。ペプチドターゲットバインダーの親和性を向上させるために、アミノ酸の単一置換および二重置換スキャンによって、結合モチーフを最適化することができます。

【解析例】
下図は、ディスプレイスクリーニングの16,000以上のペプチド候補をトリプリケートで、ディスカバリーフォーマットのマイクロアレイにプリント(左上)した結果です。アレイは、タグ付けされた標的タンパク質およびタグ特異的蛍光色素と共にインキュベートされます。ペプチド候補はセレクションされ、単一および二重置換スキャンによって、さらに最適化されます。このアミノ酸置換スキャンにより、標的タンパク質のペプチドに対する結合能を向上させます。


サンプル条件

各アプリケーションで解析に必要なサンプル条件が異なります。詳しくは弊社までお問合せください。
プロジェクト目的(アプリケーション)や抗原の配列長、生物種(ヒト、マウス)、サンプルタイプ(血清、モノクローナル抗体など)、解析サンプル数などをご連絡ください。
サンプルが血清などの場合は、解析目的の抗体クラス(IgG、IgM、IgE、IgAなど)をご連絡ください。
サンプルが抗体の場合は、二次抗体を使用した検出系を利用するため、抗体のホスト(マウス、ラットなど)およびアイソタイプ(IgGなど)をお知らせください。モノクローナル抗体の場合は、ウェスタンブロット測定(変性条件下)での、目的のバンド検出の有無をご連絡ください。

以下の条件は解析の目安です。使用するアレイのフォーマットや抗体のクラス、合成ペプチドの種類によって必要量が異なる場合があります。
アプリケーション 条件
リニアエピトープマッピング ・抗原タンパク質のアミノ酸配列情報
・20μL以上の血清または20μL以上の精製抗体
立体配座エピトープマッピング ・抗原タンパク質のアミノ酸配列情報
・N-C末端還化方法に指定がある場合はその情報
・20μL以上の血清または20μg以上の精製抗体
エピトープ置換スキャン ・単一または二重置換スキャンの開始エピトープおよびペプチド配列情報
・単一置換の場合は、20μL以上の血清または20μg以上の精製抗体
・二重置換の場合は、100μL以上の血清または100μg以上の精製抗体
抗原とエピトープの同時探索 ・ランダムペプチド、カスタムぺプチドライブラリー、またはオーバーラップペプチドなどの抗原配列情報
・スタンダードフォーマットの場合は、20μL以上の血清または20μg以上の精製抗体
・ディスカバリーフォーマットの場合は、100μL以上の血清または100μg以上の精製抗体
免疫モニタリング ・抗原タンパク質のアミノ酸配列情報
血清バイオマーカー探索 ・抗原タンパク質のアミノ酸配列情報、またはペプチドライブラリー情報
・スタンダードフォーマットの場合は、20μL以上の血清または20μg以上の精製抗体
・ディスカバリーフォーマットの場合は、100μL以上の血清または100μg以上の精製抗体
ペプチドターゲットバインダー開発 ・ランダムペプチド、または事前に選択されたペプチドライブラリー情報
・100μg以上の精製標的タンパク質(ビオチン、Flag、HisまたはHAなどのタグ付きのもの)


納品データ・価格


弊社より、下記の納品物をCD/DVD形式に収録してご報告いたします。

◆納品物
ご選択頂いたアプリケーションによって、データの形式が変更される場合があります。
・プロトコール、実験内容、実験結果を含む最終レポート(PowerPoint形式)
・ペプチドアレイ解析データ(Excel形式)

◆価格
サービス名 解析アプリケーション 税別価格 カタログ#
PEPperMAP® Peptide Microarray
受託解析サービス
リニアエピトープマッピング お問合せ F-PEP-LEM-[サンプル数]
立体配座エピトープマッピング F-PEP-CEM-[サンプル数]
エピトープ置換スキャン F-PEP-ESS-[サンプル数]
抗原とエピトープの同時探索 F-PEP-AED-[サンプル数]
免疫モニタリング F-PEP-IMM-[サンプル数]
血清バイオマーカー探索 F-PEP-SBD-[サンプル数]
ペプチドターゲットバインダー開発 F-PEP-PTB-[サンプル数]


ご注意事項(必ずご確認ください)


1. 解析サービスに関して
本サービスの解析は、弊社の海外提携先(PEPperPRINT社)にて実施されます。
2. サンプルの送付および取り扱いに関して
2.1. サンプルの発送は、必ず「サンプル送付方法および注意点(PDF)」をご参照の上、その内容に従って行ってください。送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。サンプルの入ったチューブに油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバック等に入れてください。精製抗体・タンパク質などのサンプルは、十分量の砕いたドライアイスとともに梱包し、凍結状態にてご送付ください。
2.2. サンプルは、なるべく休日を挟まない様に、弊社営業時間内(土日祝日、年末年始等を除く、平日9時~18時)に到着する様にご発送ください。なお、ご発送時の送料はお客様負担となります。着払いではお受け取りできませんので、あらかじめご注意ください。
2.3. サンプル送付の際は、受託解析サービスQCシートおよび免責事項同意書を同封してください。これらが同封されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスに着手できませんので、ご注意ください。
2.4. 解析に必要な量に満たなかった場合、サンプルの再送をお願いする場合があります。なお、再度サンプルをお送り頂く場合、提携先への再送料金をご負担頂きます。
2.5. サンプル喪失等に対する補償・保険制度はありませんので、貴重なサンプルをご提供頂く際はご注意ください。
2.6. お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティレベル2)までのものに限られます。感染性が著しく高いサンプル(HIV、HCV、HBVなど)に感染していることが確認されている患者由来の検体など)は、お預かりできませんので、予めご了承ください。
ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。また、動物検疫・国際条約等に該当するサンプルの場合、輸送手続きに日数を要する、又はお取り扱いできないことがあります。こうしたサンプルは、弊社提携先にて受入れが不能、又は拒否されたりする場合があります。
2.7. ご提供頂いたサンプルの返却は致しておりません。(サンプルは解析終了時に破棄されます。)
2.8. 本確認事項を満たさない事で別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。
2.9. サンプル・業務等から生じた知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題について、弊社は一切の責任を負わないものとします。
3. キャンセルに関して
本サービスは、海外での解析という性質上、サンプル受領後のキャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合、それまでの工程に応じた料金をご請求させて頂きます。
4. 納品物に関して
弊社での解析データ保管期間は、発送日から90日間です。保管期間を経過したデータは破棄されますので、納品データのバックアップは、必ずお客様にてお取りください。

お問い合わせ 受託解析部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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