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Arraystar社 RNAメチル化アレイ解析
エピトランスクリプトームマイクロアレイ受託解析サービス

本サービスは、mRNAおよびlncRNA、またはcircRNAにおいて主要なN6-メチルアデノシトシン(m6A)におけるエピクリプトーム修飾の定量化を行うことができます。


概要


m6A、m1A、m5C、およびシュードウリジンなどのRNA修飾は、エピトランスクリプトーム、および遺伝子発現制御に深く関係しています。特にm6Aは、mRNAおよびlncRNAにおけるもっとも豊富な内部修飾となっており、転写後mRNA/lncRNA代謝、および機能のあらゆる局面に影響を与えます。さらに、m6Aは、キャップに依存しないcircRNAの翻訳開始やPrimary microRNA(pri-miRNA)のプロセシングなど、他の多くのncRNAの機能にも関与しています。
RNAの潜在的な影響は、遺伝子転写物だけでなく、転写物の修飾率にも影響します。しかしながら、現在のトランスクリプトームワイドのRNA修飾プロファイリングにおいては、主に修飾部位のマッピングは扱うものの、その転写物についての修飾RNAの割合を定量化するところまでは至っていませんでした。

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特長


本サービスで使用するエピトランスクリプトームマイクロアレイは、2色チャンネルマイクロアレイテクノロジーと、RNA修飾免疫沈降法を組み合わせて、転写産物をアイソフォーム特異的にRNAの修飾レベルの割合を定量化します。このマイクロアレイは、mRNA、lncRNA、circRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、snoRNA、およびsnRNAの各クラスのエピトランスクリプトームをカバーしています。

エピトランスクリプトームマイクロアレイは、シークエンスによるRNAメチル化解析(MeRIP-Seq)よりも優れた利点を持っています。
どの遺伝子転写産物が修飾されているか、条件間の差動的な修飾、各転写産物に対する修飾の割合を単一のマイクロアレイで同時にプロファイルすることが可能です。
MeRIP-Seqでプロファイリングが困難なlncRNAやcircRNAであっても、コード、ノンコードのRNAクラスのカバレッジが可能です。
rRNAの除去が不要で、MeRIPよりも迅速かつ簡単に解析が行えます。
少量サンプルでの解析が可能で、1μgのtotalRNAから解析が可能です。

【少量のサンプルでの解析】

現在のMeRIP-Seq法では、スタートサンプルとして120μg以上のtotalRNAが必要であるため、入手量が限られる希少サンプル等の研究は非常に困難です。このサービスで使用するアレイは、1μgのtotalRNAしか必要としないため、MeRIP-Seqを大幅に下回るスタートサンプルで解析が可能です。
サンプル条件 エピトランスクリプトームマイクロアレイ MeRIP-Seq
スタートサンプル量 ≧1μg total RNA ≧120μg total RNA
mRNAおよびrRNAの除去 不要 必要
インタクトRNA 不要 必要

【マイクロアレイによる各転写産物の修飾率の定量化】

変化する修飾化学量論は、同じRNA転写物から機能的多様性を生み出します。修飾RNA(転写産物a)の割合は、ある細胞条件下(例えば細胞状態1)では非常に低くなり得るが、別の細胞条件下(例えば細胞状態2)では高く変化する場合があります。RNAの構造変化や修飾リードタンパク質の直接動作に引き起こすことで、修飾された(転写産物a)は、例えばタンパク質翻訳から、増加したRNAの崩壊まで、異なる運命を獲得します。



エピトランスクリプトームマイクロアレイは、Cy5チャンネルで免疫沈降した修飾RNAと、Cy3チャンネルで上清の未修飾RNAをそれぞれ検出し、各転写産物の修飾および未修飾の割合を測定します。これらスプライスされた転写物アイソフォームは、転写物特異的なアレイプローブによって特異的かつ明確に検出します。



マイクロアレイデータベース


本サービスは、解析内容に合わせて、mRNA & lncRNA 解析用のアレイと、circRNA 解析用のアレイの2タイプからご選択いただけます。

【mRNA & lncRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ】
プローブ総数 60,613(Human), 60,773(Mouse), 40,991(Rat)
プローブ長 60 nt
プローブサイト mRNA & lncRNA:転写物の全長に沿った特異的エクソンまたはスプライスジャンクション配列。
中サイズncRNA:ncRNA内のユニークな配列領域。
プローブ特異性 転写物特異的
標識法 cRNAは、少量の分解RNAでも3'バイアスなしで全長に沿って標識。
タンパク質コードmRNA数 44,122(Human), 48,161(Mouse), 27,770(Rat)
lncRNA数 12,496(Human), 8,393(Mouse), 10,582(Rat)
中サイズncRNA数 Human:1,366(pre-miRNA)、1,642(pri-miRNA)、19(snRNA)、786(snoRNA)
Mouse:701(pre-miRNA)、957(pri-miRNA)、1229(snRNA)、1,200(snoRNA)
Rat:432(pre-miRNA)、449(pri-miRNA)、155(snRNA)、1,469(snoRNA)
mRNAソース Human:Refseq, UCSC, GENECODE, FANTOM5 CAT[2-6]
Mouse:Refseq, UCSC, GENECODE [2-3]
Rat:Refseq, Ensembl 92 [1, 5]
lncRNAソース
Arraystar lncRNA コレクションパイプライン
2018年までのすべてのデータベースおよび文献からのlncRNA
各lncRNA遺伝子の転写物に割り当てられた「Canonical」または「longest」の優先順位。
外部データベース(2018年現在)
Human:Refseq, UCSC, GENCODE, FANTOM5 CAT, LncRNAdb, RNAdb, NRED [2-8]
Mouse:Refseq, UCSC, GENCODE, GenBank, lncRNAdb, NRED [2-7]
Rat:Ensembl 92 [1], Refseq [5]
文献
Human: Scientific publications up to 2018 [9-45]
Mouse: lincRNA catalogs [8-11], T-UCRs [12], Evolutionary constrained LncRNAs [13], lncRNA publications up to 2018 [14-22]
Rat: T-UCRs [6-9]
中サイズncRNAソース HumanおよびMouse:GENECODE, miRBase [1-2]
Rat:GENECODE, miRBase, GtRNADb [2-3]
アレイフォーマット 8×60K

リファレンスリスト: Human, Mouse, Rat
※生物種をクリックするとダウンロードできます。


【circRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ】
プローブ総数 13,617(Human)、14,236(Mouse)、14,145(Rat)
プローブ長 60 nt
プローブサイト 環状ジャンクション
プローブ特異性 転写物特異的
標識法 環状RNAの特異的かつ効率的な標識を確実にするためのRNase R サンプル前処理と組み合わせたランダムプライマー標識。
circRNA数 13,617(Human)、14,236(Mouse)、14,145(Rat)
circRNAソース ・外部データベース(2018年現在)
 circbase, CircNet, circRNADb[1-3]
・文献
 Human:[4-10]
 Mouse:scientific publications[4-5]
 Rat:scientific publications[4-5]
アレイフォーマット 8×15K

リファレンスリスト: Human, Mouse, Rat
※生物種をクリックするとダウンロードできます。



解析の流れ


本サービスは、MeRIP、cRNA標識、アレイ実験、アノテーションおよびデータ解析まで、フルパッケージとなっています。

【m6A-mRNA & lncRNA 解析ワークフロー】

1.RNAサンプルの受け取り
2.RNAのQCチェック
3.免疫沈降(m6A-RIP)
4.cRNA合成、および2色標識(IP-RNAをCy5標識、およびCy3上清RNAをCy3標識)
5.アレイハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャンニング
6.データ抽出、アノテーション、解析および要約


【m6A-circRNA解析ワークフロー】

1.RNAサンプルの受け取り
2.RNAのQCチェック
3.免疫沈降(m6A-RIP)
4.RNase R によるリニアRNAの除去(rRNA、lncRNA、mRNAなど)
5.cRNA合成、および2色標識(RIP-RNAをCy5標識、およびCy3上清RNAをCy3標識)
6.アレイハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャニング
7.データ抽出、アノテーション、解析および要約


【バイオインフォマティクス解析】


パッケージ内では、以下の様な内容の解析が行われます。

・異なるm6Aメチル化転写産物(mRNA、lncRNA、および中サイズncRNA)

・異なるm6Aメチル化転写産物(circRNA)

・異なるm6Aメチル化RNAの階層的クラスタリングヒートマップ

・異なるm6Aメチル化mRNAのGOエンリッチメント解析

・異なるm6Aメチル化mRNAのパスウェイ解析


参考文献

1. Gilbert WV, Bell TA, Schaening C: messenger RNA modifications: Form, distribution, and function. Science 2016, 352(6292):1408-1412.[PMID: 273113037]
2. Yang Y et al: Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Res 2017, 27(5):626-641.[PMID:28281539]
3. Alarcon CR et al: HNRNPA2B1 is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events. Cell 2015, 162(6):1299-1308.[PMID:26321680]
4. Lewis CJ, Pan T, Kalsotra A: RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol 2017, 18(3):202-210.[PMID:28144031]
5. Qin Y et al: TRIM9 short isoform preferentially promotes DNA and RNA virus-induced production of type I interfe*** by recruiting GSK3beta to TBK1. Cell Res 2016, 26(5):613-628.[PMID: 26915459]


サンプル条件


生物種 サンプルタイプ 必要量 濃度 RIN 純度
ヒト、マウス、ラット total RNA ≧5μg ≧0.1μg/μl ≧7.0 O.D.260/280:≧1.8
O.D.260/230:≧1.8
1. 電気泳動写真の添付を推奨します。
※電気泳動は、次の条件を推奨します。1.0%アガロースゲル; 1.0%TAEバッファー; 100V, 40min.
2. DNase, RNaseフリーの1.5mLまたは2mLのチューブを使用してください。(スクリューキャップ式を推奨)
3. total RNAは、RNaseフリー水(ddH2Oなど)に溶解し、-80℃で保存してください。
4. DNase処理を行うことを強く推奨します。
5. UVスペクトルベースの濃度測定法では、不正確になる場合がありますので、蛍光ベースの測定を強く推奨します。
※UVスペクトルベースで測定した場合、上記よりも多いRNAを準備してください。
6. スピンカラムでRNA抽出・精製する際、低分子のRNAなどが除去されることがあるため、必ずキットの仕様を確認してください。
7. 上記のサンプル条件は、ご準備いただく際の目安であり、最終的な品質は業務提携先でのQCチェックの結果に従います。


価格

サービス名 生物種 税別価格 カタログ#
mRNA & lncRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ
受託解析サービス
ヒト お問合せ F-AS-MELRH-(サンプル数)
マウス F-AS-MELRM-(サンプル数)
ラット F-AS-MELRR-(サンプル数)
circRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ
受託解析サービス
ヒト F-AS-MECRH-(サンプル数)
マウス F-AS-MECRM-(サンプル数)
ラット F-AS-MECRR-(サンプル数)


ご注意事項(必ずご確認ください)

1. 解析サービスに関して
本サービスの解析は、弊社の海外提携先(Arraystar社)にて実施されます。
2. 解析に利用する製品に関して
本サービスで使用するマイクロアレイは、事前の予告無くバージョンアップされる場合があります。
3. お見積りに関して
正式なお見積りは、直接販売の場合には、直接ご提出いたしますが、代理店経由の場合は代理店よりご提出させて頂きます。
4. サンプルの送付および取り扱いに関して
4.1 サンプルのご発送は、必ず、サンプル送付方法およびご注意点(PDF)の内容に従ってください。送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。サンプルの入ったチューブには、油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバッグ等に入れてください。RNAサンプルは、十分量の砕いたドライアイスとともに梱包し、クール便でお送りください。
4.2 サンプルは、なるべく休日をはさまない様に、弊社営業時間内(土日祝日、年末年始等を除く、平日9時~18時)に到着する様にご発送ください。なお、ご発送時の送料はお客様負担となります。着払いではお受け取りできませんので、あらかじめご注意ください。
4.3 サンプル送付の際は、QCシートおよび免責事項同意書を同封してください。これらが同封されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスには着手できませんので、ご注意ください。
4.4 ご送付いただいたRNAの品質チェックの結果、解析に必要な量が不足または低品質であった場合、サンプルの再送をお願いする場合があります。なお、再度サンプルをお送りいただく場合、提携先への再送料金をご負担頂きます。
4.5 弊社に起因しない(国内および国際輸送時など)サンプル喪失等に対する補償・保険制度はありませんので、貴重なサンプルをご提供頂く際はご注意ください。
4.6 お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティーレベル2)までに限られます。感染性が著しく高いサンプル(HIV、HCV、HBVなどに感染している検体など)は、お預かりできません。ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。
4.7 ご提供頂いたサンプルの返却は致しておりません。(サンプルは解析終了時に破棄されます。)
4.8 本確認事項を満たさない事で別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。
4.9 サンプル・業務等から生じた知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題について、弊社は一切の責任を負わないものとします。
5. キャンセルに関して
本サービスは、海外での解析という性質上、サンプル受領後のキャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合、それまでの工程に応じた料金を請求いたします。
6. 納品物に関して
納品物は、代理店経由でのお取引の場合、基本的に代理店を介してお送りします。納品データのバックアップは、必ずお客様にてお取りください。弊社でのデータ保管期間は、発送日から90日間です。弊社での保管期間を経過したデータは破棄されます。


*本サイトの情報は、Arraystar社のHomepageの情報を一部引用しております。

お問い合わせ 受託解析部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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