製品・サービス情報
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Arraystar社 RNA構造プロファイリングアレイ
ｒG4 Array 受託解析サービス |
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 概要
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RNA G-四重鎖（RNA G-quadruplexes：rG4）は、グアニンに富む RNA 配列がフーグスティーン水素結合を介して形成する非標準的な二次構造です。これらの構造は、K∔などの一価陽イオンによって安定化された、積層した平面状の G-四重鎖から構成されます（図1）。
rG4 の動的な折り畳みと展開は、RNA転写［1］、クロマチン修飾因子のリクルート［2］、pre-miRNA プロセシング［3］、mRNA 翻訳［4,5］、および
mRNA 安定性［6］ を制御します。さらに、rG4 は、m7G［3］、o8G［7］ および m6A［8,9］ などの RNA 修飾と共調節して遺伝子発現を制御します。rG4
形成の調節異常は、ストレス応答［7］、癌遺伝子発現調節［10, 11］、およびパーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症における α-シヌクレイン凝集などの疾患に関与しています［12］。
図1. GリッチRNA配列では、4つグアニンがフーグスティーン結合で結合してG四重鎖を形成することがある。G-四重鎖は積み重なってRNA G-四重鎖（RG4）を形成する［13］。 |
ｒG4 マイクロアレイプロファイリング技術は、トランスクリプトーム中の ｒG4 構造を正確に定量化します。この技術には、生体内ジメチルスルフェート（DMS）処理、in
vivo RNA リフォールディング、抗 G4 抗体を用いたアフィニティーキャプチャーといった重要なステップが含まれます。次に、捕捉された rG4
含有 RNA に対し脱メチル化処理を行い、DMS 処理によって生成された副産物を除去するとともに、m1A/m3C に起因するバイアスを排除します。最後に、高感度
Arraystar rg4 マイクロアレイを用いて rG4-RNA を定量化します。これらの技術により、生細胞中の rG4 を効果的に捕捉・検出できるだけでなく、DMS
による修飾によって生じるバイアスも排除されるため、rG4 定量プロファイリング結果の精度と信頼性が大幅に向上します。
⇒詳細（PDF）はこちら
⇒Reference（PDF）はこちら
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 特長
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本サービスには、以下の特長があります。
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DMSを用いた in vivo 処理と in vitro での再フォールディングにより本来のネイティブ型 rG4 構造を回復させる。 |
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高選択性かつ高効率な BG4 抗体を用いて、rG4 含有 RNA 断片を濃縮する。 |
| ◆ |
脱メチル化処理により、m1A および m3C 修飾によって生じるバイアスを除去する。 |
| ◆ |
低存在量でも rG4-RNA を高感度に検出、プロファイリング解析できる。 |
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 ｒG4 の注目トピック
 マイクロアレイの詳細
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本サービスで使用するマイクロアレイのスライドコンテンツは、以下の通りです。本サービスは、ヒトに対応しています。
◆Human rG4 Microarray Specifications
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| プローブ総数 |
14,708 |
| RNA 中の rG4 領域を標的とするプローブの総数 |
13,708 |
| 3’-UTR 内の rG4 部位 |
5,097 |
| 5’-UTR 内の rG4 部位 |
1,697 |
| CDS 内の rG4 部位 |
3,053 |
| lncRNA 中の rG4 |
3,861 |
| ショウジョウバエの mRNA をコードするスパイクイン制御プローブ |
1,000 |
| rG4 サイトの情報源 |
rG4s：literatures［1-14］, G4Atlas［15］, QUADRatias［16］
G4s：EndoQuad［17］, G4Bank［18］ |
| ショウジョウバエの mRNA をコードする遺伝子源 |
ENSEMBL BDGP6, 46［19］ |
| アレイフォーマット |
8×15K |
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◆RNA G-四重鎖（rG4）データベース
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| Databese |
Introduction |
Link |
| G4Atlas |
信頼性の高い実験的に検証された rG4 データと予測された rG4 データを統合した、包括的なトランスクリプトームワイド RNA G 四重鎖（rG4）データベース |
https://www.g4atlas.org/ |
| QUADRatlas |
ヒト rG4 とその相互作用ネットワークに関する厳選されたリソース
3つのツールによる実験的（rG4-seq、RT-stop profiling）および計算的予測を組み合わせて、217, 424 個の rG4
領域を特定 |
https://eg4db,cibio.unitn.it/ |
| EndoQuad |
ヒト、マウス、ニワトリの内因性 G4（eG4）に特化したデータベース
ゲノムワイドな実験的に検証された eG4 データを提供 |
https://chenzxlab.hzau.edu.cn/EndoQuad/#/ |
| miRNA のカバレッジ |
13種の生物種にわたって実験的に同定された 6, 915, 983 個の DNA G4 配列のリポジトリ |
http://tubic.tju.edu.cn/g4bank/ |
⇒References（PDF)はこちら |
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解析の流れ
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本サービスは、RNA QC チェック、アレイ実験、アノテーションおよびデータ解析まで、フルパッケージとなっています。
【ワークフロー】
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1．DMS 処理 Total RNA サンプルの受け取り
2．RNA の QC チェック： Total RNA の純度および量の測定、完全性の評価
3．RNA 断片化および in vivo RNA 再フォールディング
4．rG4 の BG4 抗体による免疫沈降
5．AlkB 脱メチル化
6. cRNA の合成と標識
7. アレイのハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャンニング
6．データ抽出、アノテーション、解析および要約
図2. rG4 Array プロファイリングのワークフロー
培養細胞を DMS 処理することで、A、C、G はメチル化されるが、rG4 内の G はメチル化されない。単離した RNA を K 存在下で、in
vitro で断片化、変性、および再形成すると、m7G 修飾から保護されていた in vivo rG4 領域のみが再フォールディングされる。rG4
構造を含む RNA は、抗 G 四重鎖抗体（BG4）で免疫沈降する。濃縮した RNA を脱メチル化し、T７ プロモーターを付加して二本鎖 cDNA
に逆転写する。蛍光標識アンチセンス cRNA を、Cy3-CTP 色素基質を用いて T7 プロモーターから T7 ポリメラーゼにより in vitro
で転写する。この cRNA を Arraystar rG4 アレイにハイブリダイズさせ、トランスクリプトーム中の rG4 領域を解析する。 |
【納品物】
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解析終了後、弊社報告書のほか、以下のデータを DVD 等の記録メディアに収録してご提供いたします。
1．解析ソフトウェア上から生成された全てのマイクロアレイ生データファイル
2．Arraystar社による実施プロジェクトの解析レポート（word形式）
3．以下に関するデータ表（エクセル形式）（標準カットオフは |FC|≧2、p≦0.05）
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生データおよび正規化後の強度値 |
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rG4 に関するアノテーション（シグナル品質でフィルタリング済み）：RNA 配列上の位置、mRNA 領域（5'UTR、CDS、3'UTR）におけるサイト位置、関連する mRNA および lncRNA |
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有意差が認められた rG4 部位（標準カットオフ値は |fold change|≧2、p≦0.05） |
4．スキャッタープロット、階層クラスタリングヒートマップ、およびボルケーノプロット（レプリケートがあり、p値算出が可能な場合）
5．変動 mRNA rG4 部位の Gene Ontology 解析およびパスウェイ解析
6．発現変動 DoG RNA のパスウェイ解析
7．サンプル QC レポート |
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サンプル条件
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| 品質条件 |
詳細 |
| 対応生物種 |
ヒト |
| サンプルタイプと必要量 |
DMS処理済み細胞（＞1x107個）から抽出した Total RNA（DMSO処理プロトコル） |
| 濃度（Nanodrop に基づく） |
推奨＞100ng/μl、最低＞20ng/μl |
| 純度（Nanodrop に基づく） |
O.D.260/280：＞1.7～2.1
O.D.260/230：＞1.8 |
| RNA Integrity |
ゲル電気泳動：18Sおよび28S rRNA のバンドが確認でき、28Sおよび18S rRNA のバンド比が2：1程度であること。
BioAnalyzer：RIN＞7.0
※血清、血漿、エクソソームおよびFFPEなど、分解や断片化され品質低下がよく知られているサンプルに由来するRNAについては、解析結果の品質が低い可能性があります。お客様の同意があれば、ご提出いただいたサンプルで解析を行うことは可能ですが、データ品質が悪い、あるいはデータが取得できない可能性もあり、データ取得の保証はできませんので、予めご注意ください。 |
| ※ |
DNase, RNaseフリーの1.5mLまたは2mLのチューブを使用してください。（スクリューキャップ式を推奨） |
| ※ |
ヌクレアーゼフリーの分子生物学グレードの水に溶解し、-80℃で保存してください。 |
| ※ |
サンプルは、DNase処理を行うことを推奨します。 |
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価格
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本サービスのご依頼方法、注意事項につきましては、「受託解析サービスの流れ」をご一読ください。
| サービス名 |
生物種 |
税別価格/サンプル |
カタログ＃ |
| ｒG4 Array 受託解析サービス |
ヒト |
￥253,000 |
F-AS-RMH1-［サンプル数］ |
※この他、サンプルの海外輸送費が別途必要となります。
【納期】
約1.5～2ヶ月
※サンプルQC合格の場合 |
＊本サイトの情報は、Arraystar社のHomepageの情報を一部引用しております。
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