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　なぜ Downstream-of-Gene Transcripts (DoG RNAs) を研究するのか？

・DoG RNA とは？
・DoG RNA は疾患における遺伝子転写を調節する
・がん・疾患における DoG 由来キメラ RNA と circular RNA
・DoG RNA のエピジェネティックおよびエピトランスクリプトーム制御
・DoG RNA 研究の道筋

◆DoG RNA とは？

Downstream-of-gene (DoG) RNA （遺伝子下流 RNA）は、ホスト遺伝子の～10％の下流で発生し、上流の RNA と連続する RNA 転写産物です［1］。DoG は、転写終結店（TES）のポリアデニル化シグナル（PAS）を越えて 5kb 以上の長さを持つと定義され、哺乳類細胞では最大 200kb の長さを持ちます［1］。DoG はその長さから、リードイン遺伝子と呼ばれる他の下流転写ユニットとしばしば重複します（図1）［2, 3］。

図1．通常の条件下では、リードイン転写のない正常な mRNA を生成。細胞ストレスは「Downstream-of-Gene」転写産物（DoGs）の産生を誘発する。DoG の中には、「リードイン」遺伝子と呼ばれる、その下流の遺伝子にまで転写を拡大するものがある［2, 3］。合成後、多くの DoG は転写部位の近くに留まるが、一部 DoG は核小胞内に放出される［1, 4］。ポリアデニル化された DoG もポリアデニル化されていない DoG も、同程度のレベルで検出されている［5］。略語： TSS：転写開始点; TES：転写終結点。

＜DoG の分子的特徴＞

DoG は、リードスルー転写によって発生します。このプロセスは、新生 mRNA の3'末端の終結が効率的でない場合に起こり、遺伝子の正常末端を超えて転写が継続します［6］。DoG には 3つの特徴があります（図1）［7］：（1）タンパク質をコードするホスト遺伝子のプロモーターから転写が開始される。DoG の産生には、独立した転写開始部位（TSS）からの de novo 転写開始は含まれない。（2）ホスト遺伝子の 3'末端ポリアデニル化シグナル（PAS）を超えて、少なくとも 5kb にわたって連続的に伸長する。（3）主に核に局在し、クロマチンに結合している可能性が高い。注目すべきは、DoG の産生はホスト遺伝子の転写活性には依存せず、その調節メカニズムは明確に独立し、関連していないことです。

＜DoG の生合成＞

正常な転写終結には、RNAポリメラーゼ RNAPII の減速、一時停止、脱離、RNA転写産物の 3'末端切断など、複数の協調的なイベントが必要です。これらのステップのいずれかが乱れると、転写終結に影響を与え、転写のリードスルーにつながる可能性があります（図2）。浸透圧ストレス［5］、ヒートショック［8］、ウイルス感染［3、9］、がん誘発性突然変異などの細胞ストレスはすべて、転写終結の異常を促進する可能性があります。ストレス条件下では、多くの遺伝子がポリアデニル化シグナル（PAS）を認識できなかったり、転写物の切断やポリアデニル化因子の機能不全により、転写を適切に終結できず、リードスルー転写を促進します。さらに DoG を産生する遺伝子は、転写伸長を促進するヒストンマーク（例：H3K36me3 や H3K79me2）が濃縮されていたり［10］、PASが弱いなど、しばしばリードスルー転写を起こしやすい特徴的なクロマチン特性を有しています［3］。

図2．RNAPII 転写終結を促進（上）または阻害（下）する因子、機構、または細胞条件による転写終結の制御。細胞ストレス、ウイルス感染、癌、老化によって引き起こされる転写終結欠陥は、リードスルー転写と DoG 産生をもたらす可能性がある。

【Reference】

1.	Vilborg A et al: Widespread Inducible Transcription Downstream of Human Genes. Mol Cell 2015, 59(3):449-461.[PMID: 26190259]
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3.	Rutkowski AJ et al: Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun 2015, 6:7126.[PMID: 25989971]
4.	Hennig T et al: HSV-1-induced disruption of transcription termination resembles a cellular stress response but selectively increases chromatin accessibility downstream of genes. PLoS Pathog 2018, 14(3):e1006954.[PMID: 29579120]
5.	Rosa-Mercado NA et al: Hyperosmotic stress alters the RNA polymerase II interactome and induces readthrough transcription despite widespread transcriptional repression. Mol Cell 2021, 81(3):502-513 e504.[PMID: 33400923]
6.	Rosa-Mercado NA, Steitz JA: Who let the DoGs out? - biogenesis of stress-induced readthrough transcripts. Trends Biochem Sci 2022, 47(3):206-217.[PMID: 34489151]
7.	Morgan M, Shiekhattar R, Shilatifard A, Lauberth SM: It's a DoG-eat-DoG world-altered transcriptional mechanisms drive downstream-of-gene (DoG) transcript production. Mol Cell 2022, 82(11):1981-1991.[PMID: 35487209]
8.	Cugusi S et al: Heat shock induces premature transcript termination and reconfigures the human transcriptome. Mol Cell 2022, 82(8):1573-1588 e1510.[PMID: 35114099]
9.	Heinz S et al: Transcription Elongation Can Affect Genome 3D Structure. Cell 2018, 174(6):1522-1536 e1522.[PMID: 30146161]
10.	Vilborg A et al: Comparative analysis reveals genomic features of stress-induced transcriptional readthrough. Proc Natl Acad Sci U S A 2017, 114(40):E8362-E8371.[PMID: 28928151]

◆DoG RNA は疾患における遺伝子転写を調節する

リードスルー転写と DoG RNA の機能的役割は、現在活発な研究の焦点となっており、遺伝子制御への関与を強調するいくつかのメカニズムが提案されています。

・DoG RNA は細胞老化における転写干渉を媒介する

DoG はアンチセンス RNA として機能し、収束タンパク質コーディング遺伝子の遺伝子発現を制御します。老化細胞では、老化誘発アンチセンスリードスルー RNA (senescence-triggered antisense read-through RNAs：START RNA) ファミリーが DoG として誘導されます［1］。重要な点は、START RNA は対応するセンス RNA の発現を抑制することです。
もう1つは、シロイヌナズナゲノムの低温感受性領域に位置する SVK です。SVK の RNAPII リードスルー転写は、アンチセンス鎖上の CBF1 と重複する不可解な lncRNA-asCBF1 をもたらします［2］。CBF1 は、SVK-asCBF1 lncRNA カスケードに起因する RNAPII 衝突によって抑制されます（図1）。SVK-asCBF1 カスケードは、低温ストレス時の CBF1 の発現とタイミングを厳密に制御するメカニズムを提供します。

図1．アンチセンス DoG RNA による CBF1 コーディング遺伝子発現の制御
（左）常温では、CBF1 は支障なく転写される。（右）低温曝露により、CBF1 のアンチセンス方向の SVF 転写が増加する。SVK のリードスルー転写により、CBF1 の 3'末端へのアンチセンス転写が起こる。両鎖の転写 RNAPII の占有率が増加すると、RNAPII の衝突が生じ、CBF1 センス転写が停止し、完全長の CBF1 mRNA 生成する［2］。

・DoG RNA はウイルス感染におけるゲノム 3D 構造を制御する

A 型インフルエンザウイルス（IAV）感染時、ウイルス非構造タンパク質 NS1 は、高活性ホスト遺伝子のリードスルー転写を誘導し、ホストのクロマチンからのコヒーシン解離、クロマチンループの喪失、リードスルー領域におけるクロマチンの圧縮解除を引き起こします（図2）［3］。

図2．リードスルー転写はクロマチン構造を変化させる
A 型インフルエンザウイルス（IAV）タンパク質 NS1 は転写終結を阻害し、RNAPII が終結部位を通過して進行することを可能にし、クロマチンループの喪失と局所的なクロマチン圧縮解除を引き起こす［3］。

【Reference】

1.	Muniz L et al: Control of Gene Expression in Senescence through Transcriptional Read-Through of Convergent Protein-Coding Genes. Cell Rep 2017, 21(9):2433-2446.[PMID: 29186682]
2.	Kindgren P, Ard R, Ivanov M, Marquardt S: Transcriptional read-through of the long non-coding RNA SVALKA governs plant cold acclimation. Nat Commun 2018, 9(1):4561.[PMID: 30385760]
3.	Heinz S et al: Transcription Elongation Can Affect Genome 3D Structure. Cell 2018, 174(6):1522-1536 e1522.[PMID: 30146161]

◆がん・疾患における DoG 由来キメラ RNA と circular RNA

・DoG 由来キメラ RNA

RNA ポリメラーゼII が停止シグナルをスキップし、隣接する 2つの遺伝子のリードスルー転写物前駆体が生成されるとき、キメラ RNA は、隣接遺伝子間のシスースプライシング（Cis-Spricing between Adjacent Genes： cis-SAGe）によって産生されます（図1）。ヒトゲノムのタンデム遺伝子ペアの～5％は、単一の前駆体 RNA に転写され、最終的にはキメラ RNA にスプライシングされる可能性があると推定されています。

図1．キメラ RNA
前駆体 RNA 転写物は、同じ鎖上および同じ転写方向にある 2つの隣接する遺伝子間の転写リードスルーによって生成され、その後キメラ RNA にスプライシングされる［1］。

キメラ RNA には、いくつか共通の特徴があります：（1）親遺伝子は、同じ染色体上で同じ転写方向にある隣接する遺伝子である；（2）5'側の親遺伝子は活発に転写されている；（3）親遺伝子間の遺伝子間距離は 30kb 以内である；（4）キメラの接合部位は、5'側の親遺伝子の最後から 2 番目のエクソンと 3'側の親遺伝子の 2 番目のエクソンが融合したものになる傾向があり、これは 2-2 ルールと呼ばれる；（5）キメラは一緒にスプライシングされたエクソンの端を含む正規のスプライシング部位を使用する傾向があります［2］。

キメラ RNA は、癌と正常な生理機能の両方に存在しますが、癌では誤った制御を受け、不適切に発現することがあります。たとえば、SLC45A3-ELK4 は、対応する正常な前立腺サンプルと比較して、前立腺癌で有意に高発現しています[3]。CHFR-GOLGA3 は、正常な膀胱組織よりも膀胱癌において高い頻度で検出されています[4]。前立腺癌細胞における SLC45A3-ELK4 キメラ RNA の e1e2 型は、対応する DNA 再配列がない状態で、隣接する遺伝子リードスルーのシス-スプライシングによって生成されます。CCCTC 結合因子（CCCTC-binding factor: CTCF）の絶縁体配列への結合は、キメラ転写産物の発現と逆相関しています。SLC45A3-ELK4 は前立腺癌細胞の増殖を制御し、そのレベルは前立腺癌の進行と相関しています[2, 5, 6]。

＜SLC45A3-ELK4 は long non-coding RNA として機能する＞

SLC45A3-ELK4 は、ELK4 と同じタンパク質をコードしています。興味深いことに、融合 RNA のレベルは野生型 ELK4 の 1% 未満であり、ELK4 タンパク質の一般的なプールを乱す可能性は低いです。それにもかかわらず、ELK4 ではなく融合 RNA がサイレンシングされると、アンドロゲン依存性および去勢抵抗性前立腺癌細胞の両方で細胞増殖が阻害されます。この増殖停止は、融合 RNA と ELK4 タンパク質の翻訳を阻害するようにデザインされた変異体の外因性発現によって回復されます。同じ設定で、変異体は CDKN1A および SLC45A3-ELK4 の他のいくつかの標的も抑制することができました。さらに、多くの long non-coding RNA と同様に、融合 RNA は核画分に濃縮されています。これらの結果を総合すると、SLC45A3-ELK4 は翻訳されたタンパク質ではなく RNA 転写産物によって、癌細胞の増殖を制御していることが示唆されます [7]。転写終結がない場合、上流遺伝子の末端 3’ss は除去され、末端 5’ss は下流遺伝子の最初の3’ss とスプライスシングされ、 RNAPII が 2 番目のエクソンに到達すると新生転写産物から出現します(図2)。

図2．代表的なエクソン間の遺伝子間スプライシングによって形成されたリードスルー RNA キメラの数

RNA キメラの顕著な特徴は、いくつかのキメラが異なる腫瘍サンプルで繰り返し検出されることです。例えば、CTSC-RAB38 は TCGA サンプルの 20% で検出されますが、一致している正常サンプルでは検出されません [8]。ccRCC 細胞株のキメラ RNA は、RNAi ノックダウンを用いた qPCR で検証できます(図3)。

図3．CTSC、RAB38、およびキメラ CTSC-RAB38 転写産物を標的とする siRNA を示す CTSC-RAB38 キメラ RNA 遺伝子座。

これらの転写産物は、qPCR プライマーによって定量されます。破線の曲線は、キメラ RNA を作成するスプライシングを表す。(B)3つの異なる ccRCC 細胞株 FG2 、MF、および ER における CTSC、RAB38、および CTSC-RAB38 領域での RNAi ノックダウン後の相対的な CTSC-RAB38 キメラ RNA 発現。 *コントロールと比較した T 検定により p<0.05 [8]

・DoG 由来の circular RNA

＜リードスルー転写を利用して、下流領域から circular RNA を生成可能＞

circular RNA は、リードスルー転写から効率的に生成できます。両側の逆位反復配列が転写されると、バックスプライシングが起こり、RNA サークルが物理的に形成され、新生転写産物から分離します(図4)[9]。例えば、MATR3-PAIP2 リードスルー転写は、下流の遺伝子 PAIP2 から circPAIP2 を産生します (図4)[9]。

図4．MATR3-PAIP2 のリードスルー転写により、下流の PAIP2 のエクソン 3 から 2 へバックスプライシングされ、circPAIP2 が生成される［9］。

＜リードスルー circular RNA (rt-circRNA)＞

最近、リードスルー circRNA(rt-circRNA) と呼ばれる新しいタイプの circRNA が発見されました (図5)。これらは隣接する 2つの同様の方向にある遺伝子からのエクソンをコードするハイブリッド circular RNA です。Vo らは 1,359 個のヒト rt-circRNA を報告しました[10]。

図5．rt-circRNA の生合成
リードスルー転写により、2つの隣接し、同様の方向を向いた 2つの遺伝子からコーディングエクソンを含むハイブリッド circRNA (rt-circRNA) が形成される。環状化プロセスは、反復配列を持つ長いイントロン間の塩基対形成によって媒介される [11]。

【Reference】

1.	Shi X, Singh S, Lin E, Li H: Chimeric RNAs in cancer. Adv Clin Chem 2021, 100:1-35.[PMID: 33453863]
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4.	Zhu D et al: The landscape of chimeric RNAs in bladder urothelial carcinoma. Int J Biochem Cell Biol 2019, 110:50-58.[PMID: 30818082]
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6.	Kumar-Sinha C, Kalyana-Sundaram S, Chinnaiyan AM: SLC45A3-ELK4 chimera in prostate cancer: spotlight on cis-splicing. Cancer Discov 2012, 2(7):582-585.[PMID: 22787087]
7.	Qin F, Zhang Y, Liu J, Li H: SLC45A3-ELK4 functions as a long non-coding chimeric RNA. Cancer Lett 2017, 404:53-61.[PMID: 28716526]
8.	Grosso AR et al: Pervasive transcription read-through promotes aberrant expression of oncogenes and RNA chimeras in renal carcinoma. Elife 2015, 4.[PMID: 26575290]
9.	Liang D et al: The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Mol Cell 2017, 68(5):940-954 e943.[PMID: 29174924]
10.	Vo JN et al: The Landscape of Circular RNA in Cancer. Cell 2019, 176(4):869-881 e813.[PMID: 30735636]
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◆DoG RNA のエピジェネティックおよびエピトランスクリプトーム制御

・H3K36 トリメチル化の調節異常

明細胞腎細胞癌 (ccRCC) では、転写終結の欠陥とそれに伴うスプライシングの異常により、リードスルー転写と DoG 形成が広範囲に及んでいます [1]。特に、H3K36 メチルトランスフェラーゼ遺伝子 SETD2 は頻繁に変異しています。ccRCC 細胞の SETD2 ノックアウトは、リードスルー転写を誘導しました [1]。リードスルー転写はさまざまな癌でも観察されており、この転写欠陥が細胞形質転換の一般的な原因であることを裏付けています [2, 3]。

・ヒストン H2A.Z 欠失

ヒストン H2A.Z は、DNA 修復に関連する代替ヒストン変異体です。DoG は、H2A.Z が存在しない非増殖性老化細胞で検出されます (図1)[4]。DoGは、アンチセンス転写産物として作用することにより、遺伝子発現を制御する上で重要な役割を果たすと考えられています。

図1．収束性タンパク質コーディング遺伝子の転写リードスルーによる老化における遺伝子発現の制御
老化の過程では、START RNA と呼ばれる機能性アンチセンス RNA ファミリーが、収束遺伝子の下流の転写リードスルーによって生成される。これらの RNA は、POLII　の伸長速度と H2A.Z の局所占有率の制御に依存するメカニズムによって活性化される［4］。

・RNA 修飾

m6A などの RNA 修飾は、転写終結に影響を与えます [5, 6]。植物では、m6A ライター関連因子 FIP37 の変異体が、遺伝子のサブセットでリードスルー転写とキメラ mRNA の形成を誘導します [7]。m6A 支援ポリアデニル化 (m6A–assisted polyadenylation: m-ASP) 経路はトランスクリプトームの完全性を確保しますが、これには m6A ライター関連因子 FIP37 および m6A リーダー CPSF30L が必要です [7]。FIP37 および CPSF30L 欠損植物における標的 m-ASP 経路は、転写リードスルーと mRNA キメラ形成を引き起こします (図2)。さらに、m-ASP 経路は、キメラ遺伝子/転移因子転写産物の形成を制限し、特定の遺伝子座における転移因子を制御する可能性もあります。まとめると、3'-UTR m6A の選択的認識は、不適切な遺伝子発現を制限し、トランスクリプトームの完全性を確保するためのセーフガード機構として機能します [7]。

図2．DoG 形成における m6A 支援ポリアデニル化（m-ASP）経路のモデル［7］
(1) GENE1 の 3'-UTR における m6A 導入には、m6A ライター関連因子 FIP37 が必要である。(2)m6A は CPSF30L リーダーの YTHDC 型ドメインに認識され、GENE1 の 3'-UTR での切断とポリアデニル化を促進される。(3)これにより、mRNA キメラの形成が制限される。

・m6A 修飾と R-loop

新生 RNA m6A 修飾は、遺伝子の転写終結領域における R-loop 形成を推進し、転写終結を促進します(図3)[8]。m6A メチルトランスフェラーゼ METTL3 の枯渇により、TES 周辺の m6A 遺伝子における R-loop の蓄積が劇的に減少し、その結果、転写終結欠陥とリードスルー転写を引き起こします [8]。影響を受けた TES での R-loop の回復と、それに伴うリードスルー活性の抑制には、METTL3 メチルトランスフェラーゼ活性が必要です [8]。

図3．m6A 修飾は、転写終結領域における R-loop 形成を推進し、効率的な転写終結を促進する［8］

最近、R ループは DDX21 と METTL3 のリクルートのためのクロマチンアンカーとして機能し、これらが一緒になって新生転写産物への m6A の共転写を促進することが発見されました。新生 RNA 上の m6A の存在は、主要な核内の 5'-3'エキソリボヌクレアーゼである XRN2 のリクルートとローディングに重要な役割を果たしています。転写終結の魚雷モデル（torpedo model）では、XRN2 は poly(A) 切断部位に侵入し、進行中の転写から生じた RNA を分解し、RNAPII を追いかけて DNA から除去し、効果的に転写を終結させます。YTHDC1 などの m6A リーダータンパク質は、転写終結部位に XRN2 を結合してリクルートし、終結を促進することが可能です。DDX21、METTL3、またはそれらの酵素活性の欠失など、これらのステップのいずれかが混乱すると、不完全な終結と転写リードスルーにつながります(図4)[9]。

図4．DDX21-METTL3-m6A 系は、新生 RNA に m6A を導入し、TES の R-loop を解消し、XRN2 をリクルートして転写を終了させる。これらの活性の欠失は、転写終結の欠陥、DoG 形成、およびそれに伴う DNA 損傷につながる可能性がある［9］。

【Reference】

1.	Grosso AR et al: Pervasive transcription read-through promotes aberrant expression of oncogenes and RNA chimeras in renal carcinoma. Elife 2015, 4.[PMID: 26575290]
2.	Maher CA et al: Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer. Nature 2009, 458(7234):97-101.[PMID: 19136943]
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4.	Muniz L et al: Control of Gene Expression in Senescence through Transcriptional Read-Through of Convergent Protein-Coding Genes. Cell Rep 2017, 21(9):2433-2446.[PMID: 29186682]
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7.	Pontier D et al: The m(6)A pathway protects the transcriptome integrity by restricting RNA chimera formation in plants. Life Sci Alliance 2019, 2(3).[PMID: 31142640]
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◆DoG RNA 研究の道筋

図5．DoG RNA 研究の道筋

・発現変動の検証

アレイプロファイリングで差次的に発現した DoG RNA は、発現レベルの独立した qPCR 定量によって確認することができます。さらに、RNA 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）により、DoG RNA の強度と DoG RNA の細胞内分布の両方に関する情報を得ることができます。

・細胞内分画と局在化

DoG RNA は、核内クロマチン画分に強く濃縮されていることが知られており、細胞質内の同族 mRNA とは区別されています。細胞質、可溶性核、およびクロマチン細胞内画分から単離された Total RNA の qPCR 解析は、DoG RNA 細胞内分布と機能的意味を理解するのに役立ちます。

・CRISPR　干渉

CRISPR 干渉（CRISPR interference：CRISPRi）は、上流遺伝子の転写をノックダウンするために用いることができ、DoG RNA 産生への影響や DoG RNA との関係を調べるのに役立ちます。CRISPRi では、触媒的に死滅した Cas9 （dCas9）が標的遺伝子に誘導され、切断することなくその発現を阻害します。dCas9 ドメインは、RNA ポリメラーゼ II（Pol II）の立体阻害を通じてサイレンシングを最大化するために、しばしば抑制エフェクター（例えば KRAB ドメインなど）と融合します。
以下は、SRSF1 遺伝子のプロモーターに CRISPRi を使用して、ホスト遺伝子とその DoG RNA の両方の発現をノックダウンした例です(図6)。

図6．SRSF1 遺伝子転写の CRISPRi ノックダウン(上)は、SRSF1 pre-mRNA と DoG RNA の両方を、qPCR で定量化（下）したのと同じ 40% のレベルまで協調的に減少さる。Ctrl :CRISPRi を含まないネガティブコントロール細胞; iS9:CRISPRi ノックダウン細胞。 e1–i1 : SRSF1 pre-mRNA 領域; DoG1およびDoG2: SRSF1 DoG 領域。

・アンチセンスオリゴ（Antisense Oligo： ASO）

ホスト遺伝子 mRNA 発現の ASO ノックダウンは、対応する DoG RNA のレベルを低下させることができます。重要なことに、ASO は早期の転写終結を引き起こすことも知られており、これは DoG ホスト遺伝子の任意の領域を標的にして、転写終結が DoG RNA どのように生成するかを観察するのに特に有効です [23, 24]。ASO （ここでは gapmer も）による転写終結は、内在性 RNase H による標的 RNA 切断によって媒介され、正常な転写終結の魚雷モデルと同様にエキソヌクレアーゼ XRN2 を必要とします[24, 25]。

・DRIP-seq

R-loops は、遺伝子プロモーターや転写終結領域に多く存在し、どちらも DoG ホスト遺伝子の転写や DoG RNA 形成にかかわる転写終結に重要な役割を果たしています。DRIP-seq とその類似解析は、R ループプロファイリングの一般的な方法であり、R-loop と DoG の制御に関する貴重な洞察を提供します。

・MeRIP-seq

転写終結領域に濃縮された RNA 修飾（例：m6A）は、転写終結に影響を与える可能性があります。転写終結点（TES9 での m6A の減少は、終結欠陥とリードスルー転写をもたらします［25］。MeRIP-seq は、RNA 修飾と DoG RNA の関連付けに使用できるツールです。

・mNET-seq

Mammalian Native Elongating Transcript Sequencing (mNET-seq) は、RNA ポリメラーゼII にまだ結合している新生 RNA 転写産物を捕捉してプロファイリングし、DoG RNA に関連する Pol II の一時停止、共転写 RNA プロセッシング、終結などを含む転写のさまざまな段階の解析を可能にします。

・ChIRP-MS

質量分析による RNA 結合タンパク質の包括的な同定 (Comprehensive identification of RNA-binding proteins by mass spectrometry：ChIRP-MS) は、RNA と相互作用するタンパク質をトランスクリプトームワイドに同定するために使用されてきました。DoG RNA にどのようなタンパク質因子が結合しているかを知ることで、DoG RNA の機能やメカニズムを導き出すことができます。

・Chimera RNA Analysis

キメラ RNA （cis-SAGeとも呼ばれる）は、隣接する遺伝子のシス-スプライシング/リードスルーによって形成される DoG RNA の一種です。siRNA ノックダウンと qPCR 定量を併用することで、キメラ RNA の発現、機能、分子メカニズムを解剖することができます（図5）［6］。

図5．（A）CTSC、RAB38、およびキメラ CTSC-RAB38 転写産物を標的とする siRNA を示す CTSC-RAB38 キメラ RNA 遺伝子座。これらの転写産物は、qPCR プライマーによって定量された。破線の曲線は、キメラ RNA を作成するスプライシングを表している。（B）3つの異なる ccRCC 細胞株 FG2、MF、および ER における CTSC。RAB38、および CTSC-RAB38 領域における RNAi ノックダウン後の相対的な CTSC-RAB38 キメラ RNA 発現。　＊コントロールと比較した T 検定により、p＜0.05［6］。

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