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Home製品・サービス情報受託サービス>Digital Proteomics社製 抗体シークエンス解析サービス

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Digital Proteomics社 質量分析サービス
ValensTM 抗体シークエンス解析サービス

本サービスは、インフォマティクスと質量分析を使用して、両方の抗体鎖の完全なアミノ酸配列を再構築する抗体リシークエンスサービスです。独自の技術を使用して、ソース細胞が失われたときにモノクローナル抗体のシークエンスを行います。ソースとなるDNA/RNAが利用できない場合に、プロテオミクスの技術を使用して、モノクローナル抗体の全長アミノ酸配列を決定します。
本サービスでは、マウスやラット、ヒト、ハムスターなどの複数の種の抗体や、IgGやIgMを含む複数のアイソタイプへのアプローチに成功しています。抗体フラグメントのシークエンスにも利用することができます。



特長


本サービスは、タンパク質から直接 de novo 抗体シークエンスを行います。ハイブリドーマを失ったことがありますか?抗体の元となる細胞を失ったことがありますか?本サービスは、そんな場合に有効な解析手法です。特許取得済のスペクトルのネットワークアプローチ方法とともに質量分析を使用して、重鎖および軽鎖の全長アミノ酸の情報を取得します。

様々な種に対応
 ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラマの抗体のシークエンスに成功しています。
様々なアイソタイプに対応
 IgG1、IgG2、IgMアイソタイプのシークエンスに成功しました。


ワークフロー

1. 還元ゲルを使用し、抗体の重鎖と軽鎖を分離し、ゲルバンド切り出し
2. 得られたゲルバンドの還元およびアルキル化
3. サンプルを4種類のプロテアーゼ(トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシン)で消化
4. 得られたペプチドを nanoLC-MS/MSで分析
NanoAcquity HPLCシステム(Waters社製)を備えた Orbitrap Fusion Lumos トライブリッド質量分析計(Thermo Fisher Scientific社製)を使用
5. 取得されたタンデム質量スペクトルから、Valensシステムを使用して抗体の重鎖および軽鎖の全長配列を決定

【成果物】
 ・解析レポート(PDF形式およびHTML形式)
 ・重鎖、軽鎖全長のアミノ酸配列情報(FASTA形式)


ロイシンとイソロイシンの測定(CLIPTM

タンデム質量分析(MS/MS)による de novo 抗体シークエンスでは、異なるアミノ酸の質量の違いを使用して正確に配列を決定します。質量分析ベースの de novo シークエンスでは、ロイシン(Leu)とイソロイソン(Ile)は側鎖構成の異なる構造異性体であり、113.08406Daの同質量であるという性質のため、残基の区別は困難です。
IleをLeuで置換することにより、アミノ酸組成が異なる2つのペプチドは、同じ質量を持ち、CIDまたはHCDなどの一般的に使用されるフラグメンテーションモードでは同じペプチドフラグメント質量が得られます。区別できるシグナルがないため、多くの de novo シークエンスツールでは、ペプチド内のIleまたはLeuが曖昧なXle残基として報告されます。

本サービスでは、以下の3つのアプローチを組み合わせたCLIPTM(Confirmation of Leucine or Isoleucine Presence)法を利用することで、IleとLeuを高い精度で区別しています。

1. 酵素切断特異性
MS/MS機器では、タンパク質よりもペプチドから解釈不能な断片化データを生成するため、MS/MSプロテオミクスワークフローでは、通常、酵素を使用してタンパク質をより小さなペプチドに切断します。各消化酵素には、特定の残基を切断する蛍光があります。
下図に示す様に、キモトリプシンはチロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、ロイシン(Leu)、フェニルアラニン(Phe)の後に切断する傾向があります。ぺプチンはそれほど特異的ではなく、グルタミン酸(Glu)、チロシン(Tyr)、ロイシン(Leu)、フェニルアラニン(Phe)、アラニン(Ala)の前または後を切断します。どちらの酵素もイソロイシンよりもロイシンの周りを切断する傾向があります。




2. IleおよびLeu側鎖のEThcD断片化
断片化は通常ペプチド骨格に沿って発生しますが、残基側鎖の断片化も可能です。IleとLeuの残基は同じ元素組成を共有していますが、結合パターンが異なります。側鎖のフラグメンテーションは、ペプチドのMS2フラグメンテーションによるETDフラグメンテーションと、ターゲットzイオンのMS3を生成するHCDフラグメンテーションを使用して生成することができます。未知のXleがN-Cα結合の切断にあるzイオンは、IleおよびLeuの特性wイオンになります。
下図のスペクトルに示す様に、Leu側鎖フラグメンテーションはイソプロピル基の排出(zイオンからのC3H7の欠失)をもたらしますが、Ileフラグメンテーションはエチル基の排出(zイオンからのC2H5の欠失)をもたらします。



3. V/J遺伝子相同性
IleおよびLeuを決定する3番目の方法は、抗体配列相同性を使用することです。抗体配列は、生殖細胞系列の遺伝子起源にさかのぼることができ、予測されたIleおよびLeuは、抗体で標識されたVおよびJ遺伝子セグメントのコード化コドンをチェックすることで確認できます。抗体には変異を起こしやすい相補性決定領域(CDR)が含まれています。CDR1およびCDR2の遺伝子からの翻訳されたヌクレオチドをチェックすることで、IleおよびLeuの検証を行います。CDR3の抗体は、対応する遺伝子セグメントがなく、独自に派生しています。

CLIPに関するホワイトペーパー


ケーススタディ


レイクファーマ社と共同で、抗 FLAG M2 抗体の抗体配列を決定しました。全長配列を決定し、エドマン配列の出版物の欠落領域を埋めることができました。(Roosild et al, 2006)

【Valens シークエンス】
精製した抗 FLAG M2 抗体を5つの酵素で消化し、LC-MS/MSで分析しました。
Valensは、重鎖と軽鎖の両方の完全長配列を回復しました。
予測された配列を抗 FLAG M2 の公開された配列に合わせました。
公開された配列の31の未知の残基。13アミノ酸の違い。一部のアミノ酸は機密情報のため「X」に置き換えられています。



【発現およびバリデーション】
全長抗体をコードするプラスミドDNAをCHO細胞にトランスフェクトして、HM2抗体を作製しました。精製されたHM2抗体は、複数のタンパク質への結合についてテストされ、類似の結合プロファイルと親和性(Kd)を持っていることが示されました。

- FLAGタグ付きタンパク質
(Octet)に対するKd
Hisタグ付きタンパク質
(Octet)に対するKd
3x FLAGタグ付きタンパク質
(Biacore)に対するKd
HM2 26±3 nM No binding <1nM
M2(ref) 25±4 nM No binding <1nM

【精製のためのHM2の使用】
HM2抗体は、セファロースビーズに化学的に結合されました。得られたビーズを使用して、FLAGタグ付きタンパク質を含む混合物から精製しました。上のグラフに示されている様に、HM2ビーズは、FLAGタグ付きタンパク質を特異的かつ効率的に精製でき、回収率は90%を超えます。標的タンパク質の結合容量は、HM2樹脂1mLあたり13.5mgで、Sigma M2 樹脂よりも少なくとも10倍優れています。




サンプル条件

抗体量100~200μg、濃度1μg/μl、純度>95%のサンプルが必要となります。
※溶媒のバッファー組成を必ずお知らせください。


ご注意事項

1. 解析サービスに関して
本サービスの解析は、弊社の海外提携先(Digital Proteomics社)にて実施されます。
2. お見積りに関して
正式なお見積書は、直接販売の場合には直接ご提出いたしますが、代理店経由の場合は代理店よりご提出させて頂きます。
3. サンプルの送付および取り扱いに関して
3.1 サンプルのご発送は、必ず、サンプル送付方法およびご注意点(PDF)の内容に従ってください。送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。サンプルの入ったチューブには、油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバッグ等に入れてください。
3.2 サンプルは、なるべく休日をはさまない様に、弊社営業時間内(土日祝日、年末年始等を除く、平日9時~18時)に到着する様にご発送ください。なお、ご発送時の送料は、お客様負担となります。着払いではお受け取りできませんので、あらかじめご注意ください。
3.3 サンプル送付の際は、受託解析サービスQCシートおよび免責事項同意書を同封してください。これらが同封されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスに着手できませんので、ご注意ください。
3.4 サンプルを凍結状態のまま輸送する必要がある場合は、十分量のドライアイスを同梱の上、冷凍宅急便にてご送付ください。また、解析に必要な量が確保できなかった場合、サンプルの再送をお願いする場合があります。なお、再度サンプルをお送り頂く場合、提携先への再送料金をご負担頂きます。
3.5 サンプル喪失等に対する補償・保険制度はありませんので、貴重なサンプルをご提供頂く際はご注意ください。
3.6 お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティーレベル2)までのものに限られます。感染性が著しく高いサンプル(HIV、HCV、HBVウイルス)に感染していることが確認されている患者由来の検体など)は、お預かりできませんので、予めご了承ください。ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。また、動物検疫・国際条約等に該当するサンプルの場合、輸送手続きに日数を要する、又はお取り扱いできないことがあります。こうしたサンプルは、弊社提携先にて受け入れが不能、又は拒否されたりする場合があります。
3.7 ご提供頂いたサンプルの返却は致しておりません。(サンプルは解析終了時に破棄されます。)
3.8 本確認事項を満たさない事で別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。
3.9 サンプル・業務等から生じた知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題について、弊社は一切の責任を負わないものとします。
4. キャンセルに関して
本サービスは、海外での解析という性質上、サンプル受領後のキャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合、それまでの工程に応じた料金を請求いたします。
5. 納品物に関して
納品物は、代理店経由でのお取引の場合、基本的に代理店を介してお送りします。
納品データのバックアップは、必ずお客様にてお取りください。弊社でのデータ保管期間は、発送日から90日間です。弊社での保管期間を経過したデータは破棄されます。


価格・納期
サービス名 税別価格
(1抗体あたり)
カタログ#
Valens 抗体シークエンス受託解析サービス 初回ユーザー特価
¥960,000
F-DPM-VLS-[サンプル数]
¥1,710,000


本ページは、Digital Proteomics社のホームページに掲載されている情報や画像を一部引用しています。
お問い合わせ 受託解析部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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