Biognosys AG社（スイス）と業務提携し、次世代プロテオーム解析サービス「HRM-MS(TM) タンパク質網羅的定量解析サービス（DISCOVERYプロテオミクス）」、「MRM(*1)/PRM標的タンパク質定量解析サービス（TARGETEDプロテオミクス）」をご提供致しております。 プロテオミクス解析促進のため、任意の生物学的マトリックス中の任意のサンプル種からの高含有量タンパク質定量化のための研究サービスであり、タンパク質分析に必要とされるプロテオーム全体の分析または、特定のタンパク質の定量化について、適切なソリューションを提供します。次世代プロテオミクスをリードする専門技術により、研究開発を加速する強力なパートナーとして解析データを提供いたします。 Biognosysは、以下の2つのラベルフリータンパク質定量プラットフォームを提供しています。 　1. HRM-MSTMタンパク質網羅的定量解析サービス(DISCOVERYプロテオミクス） 1回の処理または条件全体で最大9,000タンパク質までのプロファイリングを可能にし、サンプル間において発現調節されたタンパク質をクリアに同定します。このプラットフォームは、「私のプロテオームでは何が起きているのか？」という問いを明らかにする研究に理想的です。 【使用例】 ・2つの患者群からのヒトCSFサンプルにおける差次的に制御されたタンパク質の発見 ・抗体薬物治療時の一次細胞上清中の分泌タンパク質同定 ・薬物治療の際のマウス肝臓サンプルにおける活性化経路の発見 ・120検体以上の尿からの大規模バイオマーカー発見

　2. MRM/PRM 標的タンパク質定量解サービス（TARGETEDプロテオミクス）

数百または数千のサンプルで最大150のタンパク質の高スループット絶対定量を可能にします。「興味のあるタンパク質群の量的変化は？」という問いを明らかにしたい研究者にとって理想的です。 【使用例】 ・ヒト細胞培養試料におけるタンパク質定量のための高スループットMRM法開発 ・心血管疾患マーカーの定量化のためのMRMパネルの開発 ・トウモロコシの経路モデリング用多重化MRMパネルの開発

これらのHRM-MS^TMタンパク質網羅的定量解析サービス（DISCOVERYプロテオミクス）とMRM/PRM標的タンパク質定量解析サービス（TARGETEDプロテオミクス）は、抗体ベースの方法と古典的な「ショットガン(*2)プロテオミクスの間にあるタンパク質分析のスケールと精度のギャップを補完します。抗体ベースの方法（ELISAなど)は単一のタンパク質の正確な定量化を可能にしますが、単一の実験において複雑な試料中の複数のタンパク質を「多重化」することは困難です。逆に、古典的な「ショットガン」プロテオミクスは、1回の実験で多くのタンパク質を同定しますが、再現性に乏しく、サンプル間で多くのタンパク質を確実に定量することが難しくなります。HRMは、ショットガン法（高含有量）とMRM法（高い再現性と感度）の利点を組み合わせた技術となります。

*1	MRM法 MRM法は、Multiple Reaction Monitoringの略で、三連四重極型質量分析計を用いた定量分析法です。様々なイオンに対し、Q1において特定のイオンを選択し、collision cellのガス衝突誘起開裂によって、fragmentationされたイオンの中から、Q3の質量フィルターを通過させることで、特定のイオンを検出する方法です。
*2	ショットガン法 調整したペプチド混合物をLC-MS/MS法で連続的に分析し、得られたペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報から試料中に含まれるタンパク質を自動的に同定する手法です。

■Biognosys AG社の製品・サービス情報、解析データ例、文献は以下の「SCIENCE HUB」よりご覧下さい。



HRM-MS^TMタンパク質網羅的定量解析サービス

HRM-MSTMタンパク質網羅的定量解析サービス（DISCOVERプロテオミクス）は、Biognosysで発明された次世代プロテオミクス技術であるハイパーリアクションモニタリング（HRM-MSTM）により、Mass Spectrometryによる完全なプロテオームの定量化を実現したサービスです。HRMは、データ独立取得（DIAまたはSWATH）を使用して、単一の機器で数千種類のタンパク質の同定が可能で、正確な定量を可能にしています。特定のプロテオミクスのニーズを満たすために、いくつかの標準化プロテオミクスサービスをご用意しています。 【特長】 ・あらゆる生物種及び任意の生物試料に対して実施することができます。 ・少量のサンプルで解析可能です。 ・培養細胞、血液、組織、尿、CSFサンプルについて、準備するための専用プロトコールもご用意しています。 【サービスラインナップ】 ID - 短期間で費用効率の良いデータ取得 ・実績のあるHRMワークフロー ・ディープスペクトルライブラリー ・時間とコストの効率化 特長：タイムリーかつコスト効率の高い方法で、高いプロテオームカバレッジが期待される典型的なサイズのプロジェクトに最適です。 ID+ - 長いLC勾配による多くのデータ取得 ・より詳細なタンパク質を用いた、より深い分析のための伸長勾配 ・ディープスペクトルライブラリー 特長：サンプルの包括的なプロテオーム分析に最適です。 HighD - 超長時間LC勾配を特長とし、最新の高分解能質量分析計で実施 ・分析の最大深度および最も長い勾配を有し、最大数のタンパク質の同定 ・ディープスペクトルライブラリー 特長：最も広範なプロテオームプロファイリング研究に最適です。 SpeeD - 短いLC勾配で処理時間を短縮し、数百サンプル規模の解析に対応 ・大規模プロジェクトのハイスループットオプション ・ディープスペクトルライブラリー 特長：タイムリーかつコスト効率の良い方法で、多数のサンプル（＞96）をすばやくスクリーニングするのに最適です。特に、血漿、尿などの生体液サンプルに適しています。 【解析対応サンプル】 要望に応じて、翻訳後修飾または他のカスタマイズされたサービスも利用可能です。DISCOVERYプロテオミクスソリューションは、事実上あらゆる生物種および任意の生物試料に対して利用可能です。 　表：各解析について、最も頻繁に要求されるサンプルタイプの詳細情報とタンパク質同定数 【価格】 サービス名 税別単価/サンプル Cat.# DISCOVERY iD サービス お問合せ F-BGS-DSID1-（サンプル数） DISCOVERY iD+ サービス お問合せ F-BGS-DSID2-（サンプル数） DISCOVERY HighD サービス お問合せ F-BGS-DSHD-（サンプル数） DISCOVERY SpeeD サービス お問合せ F-BGS-DSISD-（サンプル数） * より精度の高いデータを取得するためには、N=3以上での測定を推奨します。 * 本サービスは、海外での解析という性質上、キャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合は、それまでの工程に応じた料金をご請求させて頂きます。QC結果やライブラリー作製等の問題で再度サンプルをお送りする場合は、別途送料をご請求させて頂きます。

MRM/PRM 標的タンパク質定量解析

LiP-HRMターゲットデコンボリューション解析（タンパク質立体構造変化の解析）

【概要】 タンパク質の機能は、その構造によって決まります。タンパク質が他のタンパク質、薬物、小型リガンド、または化学的誘導体と相互作用して、その構造をどの様に変化させるかを理解することは、生物学的プロセスを理解するために不可欠です。今日まで、タンパク質構造および立体配座変化を知るために、様々な技術が開発されてきました。しかし、それらのほとんどは、単離、精製されたタンパク質にのみ適用可能であるか、タンパク質もしくは小分子のいずれかを標識することを必要とし、高い標的親和性を有する小分子にのみ適しているものばかりでした。 限定分解（Limited Proteolysis：LiP）は、未精製溶解物中のタンパク質構造の変化を同定および分析するための無標識技術として開発されました。LiPの基本概念は、化合物の存在下または非存在下で分解を受けるタンパク質に基づきます。タンパク質が化合物に結合すると構造変化を起こし、結合部位はタンパク質分解にアクセスできない様になります。これらの効果がタンパク質分解のパターンを変化させ、質量分析によって特徴付けることができる異なるペプチド形成をもたらします。 【特長】 ・質量分析と組み合わせた限定分解（LiP-MS）は、化合物結合により誘導されたタンパク質構造変化を検出します。 チューリッヒ工科大学のDr.Paola Picotti教授の研究室は、プロテオームワイドに化合物との相互作用によって引き起こされるタンパク質の立体構造変化に対処することができる、質量分析と組み合わせた独自のLiPプロトコル（LiP-MS）を開発しました。 このLiP-MS技術は、二重プロテアーゼ消化に基づいています。天然条件下での最初のプロテアーゼ工程は、タンパク質中に部位特異的切断を生じ、それらは切断時のタンパク質の立体構造に特異的であるため、いわゆる「同型」ペプチドをもたらします。非天然条件下での第二のプロテアーゼは、完全なタンパク質消化をもたらし、ボトムアッププロテオミクスによるペプチドの同定および定量化を可能にします。 （LiP-HRMワークフロー例） 1. 天然のタンパク質をプロテイナーゼKで部分消化します。プロテイナーゼKは、3次構造の非構造化領域を優先的に切断します。 2. 化合物結合は、プロテイナーゼKによる消化パターンに影響するタンパク質立体構造を修飾します。 3. その後のトリプシン消化は、異なる断片をもたらします。 4. LC-MS分析による変化の検出と定量化 ・より複雑な細胞環境におけるターゲットデコンボリューション LiP-MS技術は、大規模なプロテオーム解析において、酵母および細菌において有望な結果を示しています。Biognosysは、ヒトなどのより複雑な生物の分析のためにこの研究を拡大しました。生物のプロテオームがより複雑になるにつれて、化合物と相互作用する可能性のある潜在的な標的タンパク質の数が増加し、より多くの「ノイズ」につながります。この分析上の課題を克服するために、Biognosysは用量反応アプローチを導入しました。タンパク質の立体構造変化と化合物の濃度との間の相関関係を示すことによって、シグナル対ノイズ比を高めることができました。これにより、複雑なプロテオミクスシステムにおいても、タンパク質-化合物相互作用の信頼性の高い予測が可能になります。 また、有意なペプチドが用量反応および高いq値に対する正の相関を介して同定されます。（下図） ・LiP-MSを用いた部位特異的な標的タンパク質相互作用の検出 タクロリスムは、移植された臓器の拒絶反応のリスクを減らすために使用してきた免疫抑制特性を持つ薬です。タクロリスムはFKBP12と相互作用してT細胞の不活性化を誘導します。LiP-MS技術を使用して、タクロリムスまたはvehicleで処理したFKBP12タンパク質ライセートを比較しました。その結果、LiP-MSを用いてタクロリスムとその標的タンパク質FKBP12との相互作用によって誘導される同型ペプチドを同定することができました。タンパク質の三次元構造の知識を応用することで、タンパク質-薬物相互作用の局在を特定することが可能です。 ・用量反応曲線を用いたLiP候補の検出 用量反応アプローチでは、いくつかの化合物濃度パターンから相関カーブを作成し、各ペプチドのLiPスコアを計算します。 計算された総LiPスコアから最も可能性の高い標的タンパク質を同定します。下図は、ラパマイシンで処理されたHeLa細胞を解析した場合の用量反応相関図とLiPスコアテーブルです。LiPスコアが高い上位10ペプチドのうちの9ペプチドは、ラパマイシンの既知の標的タンパク質（FKBP1A）と対応しました。 【プロジェクト例】 ・細胞数： 5～10x107個の凍結ペレット ・化合物条件： 最大投与量で20μL（IC50の10,000倍） ・サンプル条件： 7 dosage points, 1DMSO control, 1 positive control（各N=4, 合計36サンプル） 【価格】 サービス名 税別単価/サンプル Cat.# LiP-MSサービス お問合せ F-LiP-MS-（サンプル数） ※ より精度の高いデータを取得するためには、N=3以上での測定を推奨します。 ※ 本サービスは、海外での解析という性質上、キャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合は、それまでの工程に応じた料金をご請求させて頂きます。QC結果やライブラリー作製等の問題で再度サンプルをお送りする場合（Biognosys社への送付）は、別途送料をご請求させて頂きます。

サンプル送付方法と注意点
【注意点】

・	お預かりできるサンプルは、BSL2（バイオセーフティレベル2）までのものに限らせていただきます。感染性が著しく高いサンプル（HIV, HCV, HBVウイルスに感染していることが確認されている患者由来の検体など）は、お受けできませんので、ご了承ください。
・	ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得たサンプルをご提供ください。
・	ご提供頂くサンプルおよび本作業から生じる知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題については、弊社では一切の責を負いかねます。
・	お送り頂いたサンプルは、ご返却いたしかねます。実験後のサンプルにつきましては、基本的には、弊社側にて破棄させて頂きますので、ご了承ください。
・	本確認事項を満たさない事で、別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。

≫サンプル及びQCシートの送付先

フィルジェン株式会社　受託解析部　1グループ　宛 　〒459-8011　名古屋市緑区定納山1丁目1409番地 　Tel 052-624-4388　Fax 052-624-4389　E-mail biosupport@filgen.jp

実験の流れ

フィルジェン（株） 受託解析部　1グループ 1.　解析内容の打ち合わせ 　↓　アプリケーションやサンプルの種類、サンプル数などの内容をお聞きし、お見積もりや必要サンプル量、 　↓　サンプル調整について、ご連絡させて頂きます。 　↓ 2.　サンプル送付 　↓　弊社宛てで、解析サンプルとQCシートをお送り下さい。 　↓　送付された内容物を確認後、Biognosys AG社に送付します。 　↓　本サービスは、海外業務提携先での解析という性質上、キャンセルはお引き受け出来ません。 　↓　やむを得ずキャンセルされる場合は、それまでに要した費用をご請求させて頂きます。 Biognosys社（スイス） 3.　サンプル調整 　↓　・細胞、または組織の溶解、並びにタンパク質抽出を行います。 　↓　・タンパク質のトリプシン消化、精製、QCチェックを行います。 　↓ 　↓　（オプション）サンプル特異的なタンパク質に特化したアッセイライブラリーの拡張 　↓　　　・リファレンスライブラリーに含まれていないタンパク質が見つかった場合、そのカバーを行います。 　↓　　　・リクエストに応じてアミノ酸修飾のペプチドの追加も可能です。 　↓ 4.　HRMデータ取得 　↓　・サンプルは、試料注入ごとに、Biognosysが提供するHRMマップ内の全てのイオン信号を可視化的に記録する 　↓　　「DIA（data independent acquisition）法」を用いて、LC-MS/MSシステムで分析されます。 　↓　・標的サンプルに特化した条件、勾配、通過口サイズ、サイクル数で解析を行う。 　↓　・それぞれのHRMマップは、内部標準により、出来る限り最高の質量精度と保持時間で正規化されます。 　↓　・シグナル強度は、様々なレベルの信号処理アルゴリズムを用いて正規化します。 　↓ 5.　タンパク質プロファイリング 　↓　・アッセイライブラリーによりペプチドを同定し、Biognosys's Spectronaut(TM) Pulsar softwareにより、 　↓　　全てのHRMマップを定量化します。 　↓　・差次的発現分析または他の適用可能な統計的方法によって、条件間のタンパク質発現差情報を提供します。 　↓ フィルジェン（株） 受託解析部　1グループ 6.　納品データ 　　納品物： 下記解析結果をPDFやExcel形式で納品します。通常の納期は、サンプル到着後、20～30営業日程度です。 　　　 ・エグゼクティブサマリー 　　　 ・（論文に適している）材料および方法 　　　 ・正規化されたデータ 　　　　　検出されたすべてのタンパク質とその相対的なタンパク質強度 　　　　　タンパク質注釈（Uniprotのナレッジベースに基づく） 　　　 ・差動発現解析結果 　　　　　変動タンパク質の因子と有意差 　　　　　リクエストに応じて利用可能な標的タンパク質の生データ・トレース

Q&A

・有意な発現変動をとらえるのに必要なサンプル数は？ 　⇒確実性のあるデータの提供には、最小のセットアップとして、2つのサンプルで3反復、計6サンプルが望ましいです。 ・TMTやiTRAQなどの同位体標識によるアプローチに比べた場合、利点は何ですか？ 　⇒1つのサンプルから1つのデータを得られる非常にシンプルなアプローチであるため、ラベリング効率によるバイアスを 　　回避し、また、同位体標識によるアプローチで制限される比較サンプル数の問題などがありません。 ・修飾ペプチドの同定は可能ですか？ 　⇒基本的には、修飾の無いペプチドの同定のためのアッセイとなります。 　　リン酸化などのアミノ酸修飾は、リクエストに応じて対応することとなります。

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(関連試薬）
ショットガン法とMRM法とHRM法 / Biognosys社製品を使用したプロテオミクス解析ワークフロー / iRT Kit / HRM Calibration Kit / PQ500^TM Reference Peptides / Sample Preparation Kit / PlasmaDive^TM / PlasmaDeepDive^TM

（関連ソフトウェア）　Spectronaut^TM Pulsar / SpectroDive^TM