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Biognosys社 低分子-タンパク質間相互作用プロファイリング
LiP-MS ターゲットデコンボリューション解析サービス
概要 / サービスプラットフォーム / アプリケーション例 / ご依頼方法 / 価格 / ご注意事項(必ずご確認ください)


概要

タンパク質の機能は、その構造によって決まります。タンパク質が他のタンパク質、薬物、小型リガンド、または化学的誘導体と相互作用して、その構造をどの様に変化させるかを理解することは、生物学的プロセスを理解するために不可欠です。今日まで、タンパク質構造および立体配座変化を知るために、様々な技術が開発されてきました。しかし、それらのほとんどは、単離、精製されたタンパク質にのみ適用可能であるか、タンパク質もしくは低分子のいずれかを標識する必要があり、標的に対して高い親和性を持つ低分子にのみ適しているものばかりでした。
限定分解(Limited Proteolysis:LiP)は、未精製溶解物中のタンパク質構造の変化を同定および分析するためのラベルフリー技術として開発されました。LiPの基本概念は、化合物の存在下または非存在下で分解を受けるタンパク質に基づきます。化合物がタンパク質に結合すると構造変化を起こし、結合部位はタンパク質分解にアクセスできない状態になります。これらの効果がタンパク質分解のパターンを変化させ、質量分析によって特徴付けられるユニークなペプチド形成をもたらします。
得られたペプチドは、Biognosys社の独自技術であるHRMを使用して定量化されます。包括的なHRMデジタルマップによって検出可能なすべてのペプチドシグナルを取得できるため、LiPとHRMの組み合わせは、タンパク質の構造変化のプロファイリングに特に適しています。

カタログダウンロード
(PDF)


サービスプラットフォーム

【質量分析と組み合わせたLip-MSは、化合物結合により誘導されたタンパク質構造変化を検出】


チューリッヒ工科大学のDr.Paola Picotti 教授の研究室は、プロテオームワイドに化合物との相互作用によって引き起こされるタンパク質の立体構造変化に対処することができる、質量分析と組み合わせた独自のLipプロトコル(Lip-MS)を開発しました。
このLip-MS技術は、二重プロテアーゼ消化に基づいています。天然条件下での最初のプロテアーゼ工程は、タンパク質中に部位特異的切断を生じ、それらは切断時のタンパク質の立体構造に特異的であるため、いわゆる「同型」ペプチドをもたらします。非天然条件下での第二のプロテアーゼは、完全なタンパク質消化をもたらし、ボトムアッププロテオミクスによるぺプチドの同定および定量化を可能にします。




◆ワークフロー例
1. 天然のタンパク質をプロテイナーゼKで部分消化します。プロテイナーゼKは、3次構造の非構造化領域を優先的に切断します。
2. 化合物結合は、プロテイナーゼKによる消火パターンに影響するタンパク質立体構造を修飾します。
3. その後のトリプシン消化は、異なる断片をもたらします。
4. LC-MS分析による変化の検出と定量化

【より複雑な細胞環境におけるターゲットデコンボリューション】

LiP-MS技術は、大規模なプロテオーム解析において、酵母および細菌において有望な結果を示しています。Biognosys社は、ヒトなどのより複雑な生物の分析のためにこの研究を拡大しました。生物のプロテオームがより複雑になるにつれて、化合物と相互作用する可能性のある潜在的な標的タンパク質の数が増加し、より多くの「ノイズ」につながります。この分析上の課題を克服するために、Biogonosys社では、用量反応アプローチを導入しました。タンパク質の立体構造変化と化合物の濃度との間の相関関係を示すことによって、シグナルノイズ比を高めることができました。これにより、複雑なプロテオーム環境下においても、低分子-タンパク質間相互作用の信頼性の高い予測が可能になります。
また、有意なぺプチドが用量反応および高いq値に対する正の相関を介して同定されます。(下図)

【用量反応曲線を用いたLiP候補の検出】

用量反応アプローチでは、いくつかの化合物濃度パターンから相関カーブを作成し、各ペプチドのLiPスコアを計算します。



計算された総LiPスコアから最も可能性の高い標的タンパク質を同定します。下図は、ラパマイシンで処理されたHeLa細胞解析した場合の用量反応相関図とLiPスコアテーブルです。LiPスコアが高い上位10ペプチドのうちの9ペプチドは、ラパマイシンの既知の標的タンパク質(FKBP1A)と対応しました。



【対応サンプルについて】

本サービスでは、様々な生物種および任意の生物試料に対して利用可能です。これまでに、16の異なる分子とタンパク質相互作用を確認または特定するために使用されています。
・組み換えタンパク質、ヒト細胞株、真菌細胞、および昆虫細胞
・サイトゾルに局在するタンパク質
・キナーゼ、ホスフォターゼ、その他の酵素を含むタンパク質クラス
・標的タンパク質の相対IC50計算

サンプルタイプ、サンプル条件および必要サンプル量に関しては、各プロジェクトによって異なります。


アプリケーション例

【LiP-MSを用いた部位特異的な標的タンパク質相互作用の検出】

タクロリスムは、移植された臓器の拒絶反応のリスクを減らすために使用してきた免疫抑制特性を持つ薬です。タクロリスムは、FKBP1Aと相互作用してT細胞の不活性化を誘導します。LiP-MS技術を使用して、タクロリスムとビヒクル(溶媒)で処理したFKBP1Aタンパク質ライセートを比較しました。その結果、LiP-MSを用いてタクロリスムとその標的タンパク質FKBP1Aとの相互作用によって誘導される同型ペプチド(Conformotypix peptides)を同定することができました。タンパク質の3次元構造の知識を応用することで、タンパク質と薬剤の相互作用の局在を特定することが可能です。




ご依頼方法
1. 解析内容の打ち合わせ
大まかなサンプルの種類、サンプル数などの内容をお知らせください。
本サービスは大規模プロジェクト用のサービスとなっており、プロジェクト内容について、解析元であるBiognosys社とお客様の間でWeb会議が必ず必要になります。プルジェクト内容がまとまり次第、弊社からお見積りをご案内させて頂きます。
2. ご注文およびサンプル送付
ご注文を頂いた後、解析サンプルとQCシート/免責事項同意書をお送りください。ご送付頂いた内容物を確認後、Biognosys社にサンプルを発送いたします。
3. サンプル調整
細胞、または組織の溶解、並びにタンパク質抽出を行います。タンパク質のトリプシン消化、精製、QCチェックを行います。
4. HRMデータ取得および解析
サンプルは、試料注入ごとに、Biognosys社が提供するHRMマップ内の全イオンシグナルを可視化的に記録する「data independent acquisition(DIA)法」を用いて、LC-MS/MSシステムで分析を行います。標的サンプルに特化した条件、勾配、通過口サイズ、サイクル数で解析が行われます。各HRMマップは、内部標準により出来る限り高い質量精度と保持時間で正規化されます。シグナル強度は、様々なレベルの信号処理アルゴリズムを用いて正規化されます。
5. タンパク質プロファイリング
アッセイライブラリーによりペプチドを同定し、Biognosys社製ソフトウェア「SpectronautTM」により、全HRMマップを定量化します。
6. 納品
解析結果は解析元とお客様間でセミナーまたはウェビナーで提示および議論された後、最終的にPDFやExcel形式で納品いたします。
納期は、サンプル到着後1~1.5か月程度となります。
・エクゼクティブサマリー
・Material & Methods(論文投稿に適した形式)
・正規化されたデータ
 検出されたすべてのタンパク質とその相対的なタンパク質強度、または安定同位体標準が使用されている場合は絶対量
 タンパク質注釈(Uniprotのナレッジベースに基づく)
・データ解析
 集計されたLiPスコアによってランク付けされた候補標的タンパク質情報
 各候補タンパク質の化合物親和性濃度
 ※可能な場合は、上記に加えてタンパク質立体構造上の調節ペプチドのうち上位3候補のペプチドマッピング


価格

サービス名 税別価格
(1化合物当たり)
カタログ#
LiP-MS ターゲットデコンボリューション解析サービス お問合せ F-BGS-LiP

【プロジェクト例】
・サンプル:5×107~1×108個の凍結細胞ペレット

・化合物条件:最大投与量で20μL(IC50の10,000倍)
・サンプル条件:解析サンプル7用量点、DMSOコントロール×1、ポジティブコントロール×1(各N=4 , 合計36サンプル)


ご注意事項(必ずご確認ください)


【解析サービスに関して】
本サービスは、弊社の海外提携先(Biognosys社)にて解析を実施いたします。
お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティレベル2)までのものに限らせていただきます。感染性が著しく高いサンプル(HIV, HCV, HBVウイルスに感染していることが確認されている患者由来の検体など)は、お受けできませんので、ご了承ください。
ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得たサンプルをご提供ください。
ご提供頂くサンプルおよび本作業から生じる知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題については、弊社では一切の責を負いかねます。
本サービスは、海外での解析という性質上、キャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合は、それまでの工程に応じた料金をご請求させて頂きます。QC結果等の問題でサンプルを再送する場合は、別途送料をご請求させて頂きます。
本確認事項を満たさない事で、別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。

【サンプルの送付および取り扱いに関して】
サンプルの発送は、必ず、「サンプル送付方法およびご注意点(PDF)」をご参照の上、その内容に従って行ってください。
送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。
サンプルの入ったチューブに油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバック等に入れ、砕いたドライアイスとともに梱包してください。
QCシートおよび免責事項同意書をご記入の上、サンプルと同封してご送付ください。これらのシートが同封されていない場合、またはご記入漏れがある場合、解析サービスの着手が遅れる場合がございますのでご注意ください。
新鮮サンプルの場合、上記必要量のペレットを液体窒素凍結後、-80℃保存し、十分量のドライアイスを同梱の上、冷凍宅急便にて、凍結状態にてご送付ください。
本サービスは、海外での解析となりますので、お送り頂いたサンプルのご返却はできません。貴重なサンプル等はあらかじめご注意ください。

◆サンプル送付先 
※土日祝祭日および営業時間外のサンプル受け取りは不可
 フィルジェン株式会社 受託解析部 1グループ 宛
 〒459-8011 名古屋市緑区定納山1丁目1409番地
 Tel 052-624-4388 Fax 052-624-4389
 営業時間:9:00~18:00


本ページは、Biognosys社のウェブサイトの情報を一部引用しています。

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