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Arraystar社 次世代シークエンス(NGS)
tRNA-Seq 受託解析サービス

Arraystar社(アメリカ)との業務提携による tRNA シークエンシング解析では、tRNA を正確にプロファイリングし、tRNA の mutation/variant/isoform を感度よく検出するためのサンプル~データ解析の一連のサービスをご提供します。シークエンシングデータ処理と豊富な tRNA バイオインフォマティクス解析を備えた、最初で唯一の商業ベースのサービスは、標準的および非標準的な tRNA 機能および疾患に関する tRNA 研究を先導します。


概要

トランスファーRNA(tRNA) は、遍在しており、すべての small non-coding RNA 分子の中で最も豊富に存在します。翻訳における基本的な構成要素として、tRNA は mRNA コード配列およびタンパク質配列間の物理的リンクとして機能しています。細胞増殖[1]、分化[1、2]、アポトーシス[3]などの多種多様な生物学的プロセスには、常に tRNA レベルの変動が伴います。tRNA レパートリーの変化は、細胞発生中の細胞運命の選択に影響を及ぼします(図1)。調節不全の tRNA レパートリーは、腫瘍形成および癌進行を促進する可能性があります[2, 4-11]。さらに、2型糖尿病[12]、ハンチントン病[13]、HIV感染[14]など、様々な疾患において tRNA レベルと分布に乱れが示されています。tRNA レパートリーの研究は、生物学的プロセスおよびヒト疾患の研究の重要な部分となっています。


図1. 細胞運命決定における tRNA レパートリーの影響

tRNA は、はるかに多くの化学的にも多様な転写後の修飾を受け、この修飾は、tRNA の安定性、フォールディング、デコーディングに不可欠です。
ペプチド合成のためのアミノ酸キャリアーとして、tRNA はアミノ酸が付加されている必要があります。しかしながら、これらのアミノアシル化された末端や内部修飾は、tRNA-Seq ライブラリー調整時のアダプターライゲーションや逆転写の妨げになります。Arraystar の科学者は、tRNA に最適化された修飾除去と small RNA シークエンスを統合した最先端の tRNA-Seq 手法を開発し、tRNA 研究のための最も信頼性が高く正確な tRNA-Seq データを保証しています。

【Reference】

1. Gingold H, et al. (2014). A dual program for translation regulation in cellular proliferation and differentiation. Cell 158, 1281-92. PMID:25215487.
2. Pavon-Eternod M, et al. (2013). Overexpression of initiator methionine tRNA leads to global reprogramming of tRNA expression and increased proliferation in human epithelial cells. RNA 19, 461-6. PMID:23431330.
3. Mei Y, et al. (2010). Apoptotic regulation and tRNA. Protein Cell 1, 795-801. PMID:21113408.
4. Berns A (2008). A tRNA with oncogenic capacity. Cell 133, 29-30. PMID:18394985.
5. Waldman YY, et al. (2009). TP53 cancerous mutations exhibit selection for translation efficiency. Cancer Res 69, 8807-13. PMID:19887606.
6. Kushner JP, et al. (1976). Elevated methionine-tRNA synthetase activity in human colon cancer. Proc Soc Exp Biol Med 153, 273-6. PMID:995958.
7. Marshall L, et al. (2008). Elevated tRNA(iMet) synthesis can drive cell proliferation and oncogenic transformation. Cell 133, 78-89. PMID:18394991.
8. Pavon-Eternod M, et al. (2009). tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res 37, 7268-80. PMID:19783824.
9. Zhou Y, et al. (2009). High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bor*****ib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun 385, 160-4. PMID:19450555.
10. Begley U, et al. (2013). A human tRNA methyltransferase 9-like protein prevents tumour growth by regulating LIN9 and HIF1-alpha. EMBO Mol Med 5, 366-83. PMID:23381944.
11. Goodarzi H, et al. (2016). Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression. Cell 165, 1416-27. PMID:27259150.
12. Krokowski D, et al. (2013). A self-defeating anabolic program leads to beta-cell apoptosis in endoplasmic reticulum stress-induced diabetes via regulation of amino acid flux. J Biol Chem 288, 17202-13. PMID:23645676.
13. Girstmair H, et al. (2013). Depletion of cognate charged transfer RNA causes translational frameshifting within the expanded CAG stretch in huntingtin. Cell Rep 3, 148-59. PMID:23352662.
14. van Weringh A, et al. (2011). HIV-1 modulates the tRNA pool to improve translation efficiency. Mol Biol Evol 28, 1827-34. PMID:21216840.


特長


tRNA の内部および末端修飾を効率的に除去し、前例のないレベルの tRNA-Seq 効率と精度を達成
厳格な QC プロセスにより、パフォーマンスが最適かされた tRNA シークエンスメソッド
信頼できるすべてのデータベースからの包括的な tRNA トランスクリプトーム参照
徹底した tRNA アノテーションとバイオインフォマティクス解析
論文品質のグラフィックによるデータの視覚化
Arraystar社の tRNA 解析シリーズとのシームレスな統合: tRF&tiRNA-Seq、tRNA 修飾解析など


解析の流れ


本サービスは、Total RNA~データ解析までのフルパッケージとなっています。


【解析ワークフロー】
1. RNA サンプルの受け取り
2. RNA の QC チェック: 濃度、純度、完全性(分解度)
3. tRNA の単離
4. tRNA の前処理
5. ライブラリー調整および QC
6. Illumina プラットフォームによるシークエンシング
7. データ抽出、解析および要約

【バイオインフォマティクス解析】
本サービスのバイオインフォマティクス解析では、以下のデータを提供します。
サンプル QC 結果
FASTQ および FASTA 形式のシークエンスデータ(Clean reads および Trimmed reads)
データ解析:
- シークエンスデータの QC
- tRNA 参照データベースへのリードマッピングとアライメント
- adaptor-trimmed reads の長さ分布
- tRNA の同定とアノテーション
- unique mapped reads(単一箇所にマッピングされたリード)に基づく tRNA 発現プロファイリング
- unique および multi-mapped reads (複数箇所にマッピングされたリード)に基づく tRNA 発現プロファイリング
- tRNA の発現差解析(default fold changes≧1.5 and p-values≦0.05)
- 発現変動 tRNA の階層的クラスタリングヒートマップ
- 発現変動 tRNA のスキャッタープロット
- 発現変動 tRNA のボルケーノプロット図
プロジェクトサマリーレポート

【データ例】

・発現変動プロファイリング


図1. tRNA 発現プロファイリングでは、アンチコドン、配列、ドット-ブラケット構造表記、および発現レベルの詳細な注釈が付けられます。

・発現差解析プロット

図2. 発現差解析のプロット。発現変動 tRNA は、K-means クラスタリングヒートマップ、スキャッタープロットおよびボルケーノプロットで表示されます。

・様々な tRNA 種類ごとの発現レベル(有償オプション)

図3. アンチコドン別にグループ化された、様々な tRNA タイプの発現レベル


参考文献


1. AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Wang J, et al. Nature, 2022
2. The PPR domain of mitochondrial RNA polymerase is an exoribonuclease required for mtDNA replication in Drosophila melanogaster. Liu Y, et al. Nature Cell Biology, 2022
3. Neuronal Nsun2 deficiency produces tRNA epitranscriptomic alterations and proteomic shifts impacting synaptic signaling and behavior. Blaze J, et al. Nature Communications, 2021
4. A rare codon-based translational program of cell proliferation. Guimaraes J C, et al. Genome Biology, 2020
5. tRNAArg-Derived Fragments Can Serve as Arginine Donors for Protein Arginylation. Avcilar-Kucukgoze I, et al. Cell Chemical Biology, 2020


サンプル条件


品質条件 詳細
対象生物種 GtRNAdb* に登録されている全生物種
*http://gtrnadb.ucsc.edu/cgi-bin/trna_chooseorg?org=&genelist=+++Go+to+Gene+List++
サンプルタイプ Total RNA
必要量 推奨量:>10μg、最小量:>5μg
濃度(Nanodropに基づく) >20ng/μL
純度(Nanodropに基づく) O.D.260/280:1.7~2.0
O.D.260/230:>1.8
RNA Integrity ・ホルムアルデヒド変性1%アガロースゲル電気泳動:
18Sおよび28S rRNA のシャープなバンドが確認でき、28S および 18S rRNA のバンド強度比が2:1程度であること。
・BioAnalyzer: RIN>7.0

血清、血漿、エクソソームおよびFFPEなど、分解や断片化され品質低下がよく知られているサンプルに由来するRNAについては、解析結果の品質が低い可能性があります。お客様の同意があれば、ご提出いただいたサンプルで解析を行うことは可能ですが、データ品質が悪い、あるいはデータが取得できない可能性もあり、データ取得の保証はできませんので、予めご了承ください。
DNase、RNase フリーの 1.5ml または 2ml マイクロチューブを使用してください(スクリューキャップ式を推奨)
ヌクレアーゼフリーの分子生物学グレードの水に溶解し、-80℃で保存してください。
サンプルは、DNase 処理を行うことを推奨いたします。
UV スペクトルベースの濃度測定法では、不正確になる場合がありますので、蛍光ベースでの測定を強く推奨します。
UV スペクトルベースで測定した場合、上記よりも多いサンプルをご準備ください。


価格

サービス名 税別価格 カタログ#
tRNA-Seq 受託解析サービス ¥164,000 F-AS-tRseq-[サンプル数]
1サンプルの解析料金です。海外提携先への送料が別途必要になります。


ご注意事項

1. 解析サービスに関して
本サービスの解析は、弊社の海外業務提携先(Arraystar社)にて実施されます。
2. 解析に利用する製品に関して
本サービスの仕様は、事前の予告なく変更される場合があります。
3. お見積りに関して
正式なお見積書は、直接販売の場合には直接ご提出いたしますが、代理店経由の場合は代理店よりご提出させて頂きます。
4. サンプルの送付および取り扱いに関して
4.1 サンプルのご発送は、必ず、サンプル送付方法およびご注意点(PDF)の内容に従ってください。送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。サンプルの入ったチューブには、油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバッグ等に入れてください。RNAサンプルは、十分量の砕いたドライアイスとともに梱包し、クール便でお送りください。
4.2 サンプルは、なるべく休日をはさまない様に、弊社営業時間内(土日祝日、年末年始等を除く、平日9時~18時)に到着する様にご発送ください。なお、ご発送時の送料はお客様負担となります。着払いでは受け取りできませんので、あらかじめご注意ください。
4.3 サンプル送付の際は、受託解析サービスQCシートおよび免責事項同意書を同封してください。これらが同封されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスに着手できませんので、ご注意ください。
4.4 ご送付いただいた RNA の品質チェックの結果、解析に必要な量が不足または低品質であった場合、サンプルの再送をお願いする場合があります。なお、再度サンプルをお送り頂く場合、業務提携先への再送料金をご負担いただきます。
4.5 弊社に起因しない(国内および国際輸送時など)サンプル喪失等に対する補償・保険制度はありませんので、貴重なサンプルをご提供頂く際はご注意ください。
4.6 お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティーレベル2)までのものに限られます。感染性が著しく高いサンプル(HIV、HCV、HBVウイルス)に感染していることが確認されている患者由来の検体など)は、お預かりできませんので、予めご了承ください。ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。
3.7 ご提供頂いたサンプルの返却は致しておりません。(サンプルは解析終了時に破棄されます。)
3.8 本確認事項を満たさない事で別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。
3.9 サンプル・業務等から生じた知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題については、弊社は一切の責任を負わないものとします。
4. キャンセルに関して
本サービスは、海外での解析という性質上、サンプル受領後のキャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合、それまでの工程に応じた料金を請求いたします。
5. 納品物に関して
納品物は、代理店経由でのお取引の場合、基本的に代理店を介してお送りします。
納品データのバックアップは、必ずお客様にてお取りください。弊社でのデータ保管期間は、発送日から90日間です。弊社での保管期間を経過したデータは、破棄されます。


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お問い合わせ 受託解析部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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