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Home製品・サービス情報受託サービス次世代シークエンシング(概要)>MouseScan PhIP-Seq Antibody Profiling 受託解析サービス

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CDI Laboratories社 次世代シークエンシング(NGS)受託解析サービス
MouseScan
TM PhIP-Seq Antibody Profiling 受託解析サービス
HuScan PhIP-Seq Antibody Profiling / MouseScan PhIP-Seq Antibody Profiling

T7 バクテリオファージ免疫沈降シークエンス(PhIP-Seq)は、ハイスループット DNA シークエンスと次世代プロテオミクスを組み合わせて、抗原特異的抗体の個人固有のフィンガープリントを決定する多重化分析の方法です。
MouseScan
TM テクノロジーは、全マウスプロテオーム全体に対し、エピトープレベルの抗体プロファイリングを提供します。


サービス概要

T7 ファージディスプレイおよび免疫沈降シークエンシングによるヒトプロテオームレベルの自己抗体プロファイリングサービスです。MouseScanTM サービスでは、前臨床マウスサンプル(血清、血漿など)の GRCm38.p5 マウスプロテオーム全体に対する自己抗体の存在を、定量的なシークエンシングリード出力を使用したシングルウェルアッセイで解析することができます。

◆MouseScanTM とは、

初の全プロテオームのマウス自己抗体探索プラットフォームがCDI社から提供されました。
GRCm38.p5 マウスプロテオーム内の各タンパク質をダウンロードし、19-AA 重複する 62 アミノ酸ペプチドに分割しました。異なるアイソフォームおよびホモログの同一領域からの冗長配列は、95%以上の同一性の重複がある場合に削除されました。最終的なライブラリーには、50,135 のタンパク質およびタンパク質アイソフォームからなる完全なマウスプロテオームを表す 482,672 個の固有のペプチド配列が含まれています。
このライブラリーは、オリゴヌクレオチドライブラリーとして注文され、クローニングのためのアダプターでPCR増幅され、大腸菌で増殖されたT7ファージディスプレイベクターにパッケージ化されました。このライブラリーから得られたアリコートを、希釈した血清または他の抗体を含む液体と反応させます。結合した抗体は、プロテイン A/G ビーズで免疫沈降され、沈殿物は PCR で増幅され、次世代シークエンシングとその後の解析パイプラインにより配列が定量されます。このパイプラインでは、親ライブラリー内の個々のペプチドの全体的なクローン頻度を考慮し、患者サンプルの IP リードカウントを、抗体をインプットしないネガティブコントロール(モック IP)と比較します。出力データはペプチドレベルで作成されます。このプロセスのより詳細な情報は、論文(Mohan, et al, 2018)からご確認頂けます。


MouseTM PhIP-Seq Library のキュレーションおよび生産の概要

参照:Mohan et al. Nature Protocols (2018)

1. GRCm38.p5 タンパク質データベース内のすべてのマウス配列を含みます。冗長性をフィルタリングした後、50,135 個の固有のタンパク質とスプライシングアイソフォームを最終ライブラリーとしました。
2. これらのタンパク質を 19-AA オーバーラップする 45 万個以上の個別の 62mer のペプチドタイルに分割しました。これらの DNA タイルに逆翻訳し、大腸菌での発現用に調製しました。
3. 45 万個以上のペプチドタイルをコードする合成 DNA オリゴヌクレオチドを、販売可能な DNA マイクロアレイとしてベンダーに発注しました。
4. PCR 増幅した DNA をベクターにクローニングし、T7 ファージにパッケージングしました。この T7 ファージライブラリーを定期的に大腸菌で増幅させます。
5. 増殖された T7 ファージライブラリーは、意図したインプットライブラリーの 90 %以上を含むことをシークエンスにより確認され、個別のアッセイ用に増殖されます。

◆MouseScan
TM PhIP-Seq Library のメソッドおよび解析の概要

MouseScanTM スクリーニングは、事前に作成されたファージライブラリーのアリコートを、プロテイン A/G プルダウンアッセイ、シークエンシング、および解析パイプラインと組み合わせて行います。
参照:Mohan et al. Nature Protocols (2018)

1. ファージライブラリーのアリコートを 96 ウェルプレートで抗体含有サンプルとインキュベートします。通常は、ヒト血清または血漿を使用しますが、抗体を含むほとんどのサンプルを使用できます。
2. 96 ウェルフォーマットにて、抗体結合ファージは、プロテイン A/G コーティングされた磁気ビーズとセパレーターを使用して、免疫沈降されます。コントロールとして、プロテイン A/G ビーズのみのウェルを含めています。
3. 沈殿したファージから、peptide-encoding DNA を増幅し、hemi-nested PCR によってサンプルバーコードを付加します。
4. 増幅されたサンプルをプールし、シークエンスします。バーコードは、サンプル固有のシークエンスリードファイル(FASTQ)を逆多重化して出力するために使用されます。
5. FASTAQ ファイルを解析パイプラインに入力します。QC に合格したペプチドを含むファージ由来のリードは、「counts」ファイルに集計されます。ビーズのみのコントロールは、edgeR によるサンプル内正規化および「hit」同定に使用されます。

【サービス仕様】

標準サービスには、疾患(case)サンプルと対照(control)サンプルが含まれます。
1. 抗体(含有)サンプルとファージライブラリーをインキュベート
2. プロテイン A/G プルダウンアッセイ、PCR増幅、および次世代シークエンシング*を行う : 抗体サンプルおよび mock IP サンプル。
*illumina Novaseq6000, PE150
3. Raw シークエンスデータを正規化し、定量パイプラインにて解析(Mohan et al., 2018)
4. 生の解析パイプライン出力データおよび個々の 62mer ペプチドについて正規化されたヒット・コール・データを提供

【成果物】

サマリーレポート(PDF)
ペプチドヒット表
Hit Fraction Public table:
ご提供頂いたコホート全体で最も共有された50のペプチドのペプチドヒット集計値
Hit Fraction Diff table:
他のサンプルグループをご提供頂いた場合、ご提供のコントロールコホートに対して、そのグループに固有の上位50ペプチドの反応性


参考資料


HuScanTM Mouse PhIP-Seq Content List(zipファイル)
 HuScanTM 自己抗体検査には、GRCm38.p5 マウスプロテオーム全体が含まれています。

・参考文献
 メーカーのウェブサイトをご覧ください。


サンプル条件
サンプルの種類 Volume per well(μL) 必要条件
血清(原液) 20 希釈なし
血清(希釈) 20 2μL 血清/血漿 + 18μL 希釈バッファー(PBS)
※受付サンプル数:48検体以下の場合は、12検体単位で受付。


サービスの流れ


1. お見積り
解析サンプルの種類や数をお知らせください。
ご連絡頂いた内容を基に、対応する解析内容をご案内いたします。
専用のフォームにご記入いただいた内容を基に、お見積りをご案内いたします。
2. サンプル送付
弊社宛てにサンプル、QCシートおよび免責同意書をご送付ください。
ご送付頂いた内容物を弊社で確認し、弊社から、CDI Laboratories社にサンプルを送付します。
※サンプル送付の際は、注意事項がございます。発送前に必ず以下の「ご注意事項」をご確認ください。

(サンプル送付先)
 フィルジェン株式会社 受託解析部 宛
 〒459-8011 名古屋市緑区定納山一丁目1409番地
 Tel 052-624-4388 Fax 052-624-4389 E-mail biosupport@filgen.jp
3. 解析作業の実施(海外提携先)
【基本的なワークフロー】
・サンプル調製
・シークエンス作業
・データ解析
・レポート作成
4. 納品
解析終了後、CD/DVD-ROM、USBなどにより、解析データを納品いたします。
なお、納品物は、プロジェクトに依存しており、変更される場合があります。


ご注意事項

1. 解析サービスに関して
本サービスの解析は、弊社の海外業務提携先(CDI Laboratories社)にて実施されます。
2. お見積りに関して
正式なお見積書は、直接販売の場合には直接ご提出いたしますが、代理店経由の場合は代理店よりご提出させて頂きます。
3. サンプルの送付および取り扱いに関して
3.1 サンプルのご発送は、必ず、サンプル送付方法およびご注意点(PDF)の内容に従ってください。送付の際は、チューブをパラフィルムで覆い、キャップの緩みや中身の漏れがおきない様にしてください。サンプルの入ったチューブには、油性マジックでサンプル名を明記し、ビニールバッグ等に入れてください。
3.2 サンプルは、なるべく休日をはさまない様に、弊社営業時間内(土日祝日、年末年始等を除く、平日9時~18時)に到着する様にご発送ください。なお、ご発送時の送料はお客様負担となります。着払いでは受け取りできませんので、あらかじめご注意ください。
3.3 サンプル送付の際は、受託解析サービスQCシートおよび免責事項同意書を同封してください。これらが同封されていない、または記入漏れがある場合、解析サービスに着手できませんので、ご注意ください。
3.4 サンプルを凍結状態のまま輸送する必要がある場合は、十分量のドライアイスを同梱の上、冷凍宅急便にてご送付ください。また、解析に必要な量が確保できなかった場合、サンプルの再送をお願いする場合があります。なお、再度サンプルをお送り頂く場合、業務提携先への再送料金をご負担いただきます。
3.5 サンプル喪失等に対する補償・保険制度はありませんので、貴重なサンプルをご提供頂く際はご注意ください。
3.6 お預かりできるサンプルは、BSL2(バイオセーフティーレベル2)までのものに限られます。感染性が著しく高いサンプル(HIV、HCV、HBVウイルス)に感染していることが確認されている患者由来の検体など)は、お預かりできませんので、予めご了承ください。ヒト臨床サンプルの場合、インフォームドコンセントを得てからご提供ください。また、動物検疫・国際条約などに該当するサンプルの場合、輸送手続きに日数を要する、またはお取り扱いできないことがあります。こうしたサンプルは、弊社業務提携先にて受入れが不能、または拒否されたりする場合があります。
3.7 ご提供頂いたサンプルの返却は致しておりません。(サンプルは解析終了時に破棄されます。)
3.8 本確認事項を満たさない事で別途費用が発生した場合、お客様に費用のご負担をお願いすることがあります。
3.9 サンプル・業務等から生じた知的財産権・工業所有権・安全性・インフォームドコンセント等の問題については、弊社は一切の責任を負わないものとします。
4. キャンセルに関して
本サービスは、海外での解析という性質上、サンプル受領後のキャンセルはお引き受けできません。やむを得ない理由でキャンセルされる場合、それまでの工程に応じた料金を請求いたします。
5. 納品物に関して
納品物は、代理店経由でのお取引の場合、基本的に代理店を介してお送りします。
納品データのバックアップは、必ずお客様にてお取りください。弊社でのデータ保管期間は、発送日から90日間です。弊社での保管期間を経過したデータは、破棄されます。


価格・納期

【価格】
サービス名 サンプル数 税別価格 カタログ#
MouseScanTM PhIP-Seq Antibody Profiling 受託解析サービス 12 お問合せ F-CDI-MSPS-[サンプル数]
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※本サービスは、海外業務提携先で実施する解析のため、上記の解析料金の他、サンプルの海外輸送費が別途発生します。

【納期】
サンプル受領後約2.5~3.5か月


本ページは、CDI Laboratories社のホームページに掲載されている情報や画像を一部引用しています。
お問い合わせ 受託解析部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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